摘要

在硅橡膠表面制備一種具有抗感染功能的涂層—殼聚糖載銅凝膠涂層。為了克服硅橡膠的生物惰性，在其表面制備涂層，先用逐步化學接枝法對其表面進行活化預處理，然后化學接枝殼聚糖載銅凝膠涂層。對比浸泡前后涂層的形貌，研究了活化預處理對功能化涂層與硅橡膠基體之間結合性能的影響。結果表明，用化學接枝法可在硅橡膠表面生成豐富的活性官能團從而提高了功能化涂層與硅橡膠的結合強度。載銅功能化涂層使硅橡膠導管具有良好的抗菌功能。

關鍵詞： 材料表面與界面 ; 功能涂層 ; 逐步化學接枝法 ; 硅橡膠導管 ; 結合性能

高分子材料在醫療器械方面的應用十分廣泛，有良好的臨床效果。高分子材料發展迅速，種類繁多[1,2]。高分子材料可用于各類疾病的診斷和治療，包括制作植入體內的器械[3]。常用的醫用高分子材料，有聚乙烯、聚丙烯、硅橡膠、聚乳酸、聚氨酯等。硅橡膠具有高度生物惰性和超疏水性等性質，已成為主流植入器件用材料，如臨床使用的醫用導管和人工器官等[4,5]。但是，植入體內的器件可能發生血栓和感染。對慢性病患者和血液透析病人極為重要的血管植入類導管，其相關性感染（Catheter-related blood stream infection, CRBSI）已成為引起相關血液感染的主要原因。導管并發癥不僅延長病人的住院時間，增加治療費用還會加重病人的痛苦，甚至危及其生命。因此，導管并發癥受到國內外醫學專家和研究者的極大關注并引起了預防CRBSI的研究熱潮[6]。

為了消除醫用導管的臨床感染，在導管表面制備抗感染涂層成為研究的熱點。有研究表明，在導管表面制備抗菌涂層是一種解決感染的有效方法。目前已有多種功能性導管涂層。氟聚合物涂層包括：水凝膠涂層、仿生表面涂層等[7,8]；載藥涂層包括：二甲胺四環素和利福平、Ag NPs、慶大霉素、苯二酚改性殼聚糖/透明質酸載藥涂層等[9~11]；納米材料涂層包括：目前研究較多的納米銀涂層[12~14]、二氧化鈦納米管載藥涂層等。以上這些抗菌涂層，都具有較好的抗菌效果。

醫用材料抗菌表面的構建，主要是通過涂層、接枝和本體改性等途徑實現。導管表面抗菌涂層的制備簡單快捷，且不改變其機械性能。殼聚糖/銀-銅復合抗菌劑涂層的抗菌性能優良，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌率達到96%以上[13,15]。

在表面惰性的硅橡膠導管上制備抗感染功能化涂層，難度很大[16]。目前制備涂層的方法有：層層自組裝、浸涂、化學接枝法、溶膠凝膠、電泳沉積、滴涂、原位還原、聚合等[16]。高分子材料具有高度惰性和超疏水性能，在其表面制備涂層，為了使涂層與高分子基體更好的結合，需要對其表面進行活化處理[17]。目前廣泛應用的高分子表面活化方法，包括光輻射、等離子電離處理、臭氧引發等。為了使高分子表面產生極性基團，可將親水性物質化學反應接枝到材料表面[18~21]。作為物質第四態的等離子體，用于表面處理有簡捷、高效、環保等優點。但是等離子體處理技術具有時效性和損蝕性，使產業化受到限制。輻射法可使高分子材料表面活化，但是易加速其老化。化學接枝法使用硅烷化試劑等和層層自組裝過程使材料表面活化改性，適用性比較廣泛，可根據需要改性的基材特性調整化學接枝物質組成，實現功能化涂層的鍵合。已有研究報道[22],可將殼聚糖鍵合到鈦基體表面：第一，在鈦基體表面沉積硅烷（IPTS）并形成Ti-O-Si共價鍵；第二，在戊二醛與IPTS末端的NH2化學鍵合成亞胺基，以提供反應性醛基與殼聚糖分子形成共價鍵；第三，在鈦表面的醛基與殼聚糖上的氨基形成亞胺鍵。多巴胺可在多種材料表面形成聚多巴胺膜層。在硅橡膠表面制備聚多巴胺涂層可引入活性官能團實現功能化涂層與硅橡膠器件的良好結合。本文在硅橡膠表面制備殼聚糖載銅凝膠涂層并研究其抗菌功能。

1 實驗方法

1.1 涂層的制備

將厚度為2 mm的硅橡膠裁成面積為1 cm×1 cm的片狀樣品，然后用去離子水超聲清洗兩次（每次20 min），再用丙酮清洗5 min后用無水乙醇超聲清洗兩次（每次20 min），晾干后備用。

將待處理樣品浸泡在濃度為2 mg/mL的多巴胺的Tris-HCI溶液（濃度為1.0 mmol/L, pH=8.5）中，置于搖床振蕩48 h后用去離子水超聲清洗3 min,即得到表面覆蓋聚多巴胺（PDA）涂層的材料。然后將表面有PDA涂層的硅橡膠樣品浸沒在2.5%濃度的戊二醛溶液中24 h,棄去戊二醛溶液后用去離子水沖洗3次，自然晾干后待用。

配制濃度為1.5%的殼聚糖（粘度為50~800 mPa·s、脫乙酰度為90%）乙酸水溶液和質量分數為1%的CuSO4溶液，然后以10（殼聚糖）：1（CuSO4）體積比混合，再將其pH值調節至4.5。用提拉法在經多巴胺和戊二醛處理后的硅橡膠材料上制備具有抗菌性能的涂層，自然晾干后在40℃烘箱中干燥6 h。

1.2 樣品的表征

使用TBU--95靜滴接觸角測量儀測定樣品的接觸角，測試溶液為雙蒸水，液滴體積為0.6 μL。

用Buker D8 DISCOVER光電子能譜儀測試樣品的X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy, XPS），并使用XPSPEAK41軟件對不同元素的譜圖進行分峰擬合處理。用掃描電子顯微鏡（Scan-ning electron microscope, SEM, HITACHI-3400 N, Japan）觀察截面形貌并測量涂層厚度，對比浸泡前后涂層形貌變化。

抗菌功能性評價：選擇實驗室常用檢測抗菌性能的標準菌株：金黃色葡萄球菌（S. aureus, ATCC 25923）進行相關實驗。根據ISO 10993-5:2009標準，用直接接觸法檢測涂層樣品的抗菌性能和抑制生物膜形成的能力。將表面有載銅涂層的硅橡膠樣品（以殼聚糖涂層處理樣品作為對照組）放入24孔板中，在每個樣品表面滴加50 μL濃度為2.3×108 CFU/mL的S. aureus菌液。將孔板放入溫度為37℃的培養箱中孵育（5%CO2,90%濕度）培養24 h,并設置三組平行實驗以作比較。取出24孔板，吸棄細菌液并將PBS輕輕漂洗3次。在每孔加入2.5%的戊二醛溶液1 mL,在4℃冰箱中固定樣品表面細菌4 h。取出固定樣品后吸棄固定液，用PBS溶液清洗3次。依次在濃度為30%,50%,60%,70%,80%,90%,95%的乙醇溶液中梯度脫水10 min,最后在無水乙醇中脫水2次（每次5 min）。干燥24 h后用掃描電鏡觀察細菌的形貌。

2 實驗結果

2.1 預處理硅橡膠表面的XPS分析

圖1給出了硅橡膠表面經聚多巴胺涂層處理的XPS全譜以及C,N和O元素的分峰處理結果。圖1a給出了XPS全譜，涂層處理后樣品的化學組成為C,N,O和Si。根據XPS精確譜（圖1b）：N元素在硅橡膠表面存在多種形式，擬合結果表明，N元素在鍵能為400.58,398.23和397.09 eV處出現三峰。圖1c給出了O的精確譜結果，多巴胺聚合后O元素主要以苯酚和苯醌形式存在，分峰結果證實O元素的存在形式為C=O和C-O,表明聚多巴胺成功接枝在硅橡膠表面。此外，在153.29和100.31 eV處可觀察到兩個強峰，分別為硅橡膠基體中Si2s和Si2p的峰。

圖1   逐步化學接枝處理后樣品的XPS譜圖

對經戊二醛偶聯的硅橡膠樣品進行XPS檢測，并對C,N與O的精確譜進行擬合分峰處理，結果如圖1d所示，C元素結合能在286.2 eV處出現新形成的C=N亞胺基鍵。圖1e所示，在N元素結合能在397.14 eV處有C=N鍵能。如圖1f所示，與戊二醛偶聯前相比，O元素的存在形式由兩種變為三種，以上結果均表明，經戊二醛偶聯后成功地引入了醛基。

2.2 預處理硅橡膠的浸潤性

浸潤性是表征固體表面特性的一個重要參數，表示液體在固體表面鋪展的能力或傾向性，其受固體材料表面能、表面粗糙度以及表面微結構的影響。圖2給出了硅橡膠經聚多巴胺和戊二醛處理前后的水液滴形貌和相應的接觸角。硅橡膠的接觸角為110°，經多巴胺處理后的硅橡膠的接觸角為79°，說明聚多巴胺的粘附改變了硅橡膠的浸潤性。再經戊二醛處理后，硅橡膠的浸潤性與聚多巴胺涂層相比沒有明顯的改變。經聚多巴胺處理后硅橡膠的接觸角降低，表面張力下降，為后續的功能化涂層制備提供基本條件。

圖2   液滴形貌和接觸角

2.3 載銅功能涂層的XPS譜

圖3a給出了殼聚糖涂層的全譜，譜圖所示涂層中僅含有C,N,O三種元素。使用XPSPEAK41軟件對殼聚糖涂層中C、O和N三種元素的譜圖進行分峰擬合，發現C1s、N1s與O1s的峰形均與預處理后樣品的峰形有較大差異。圖3b給出了C元素的分峰擬合結果。共有3個峰，表明C元素有3種存在形式，對應的鍵能分別為282.05,283.75和285.50 eV,與之對應的存在形式為C-N、C=O和殼聚糖分子六元環內的C-O-C鍵；圖3c給出了N元素的分峰擬合結果。如圖所示，因其N元素主要以C-N狀態存在而受大環結構和分子長鏈的影響，其對應的結合能約為397 eV,其中C-N鍵能為396.68 eV。由于實驗中使用殼聚糖是脫乙酰度是90%,存在酰胺鍵（CO-NH），對應的鍵能為397.45 eV。圖3d給出了殼聚糖為O元素的分峰擬合結果。如圖所示，制備了殼聚糖涂層后Ols峰面積大大增加，是殼聚糖分子中O元素含量高的緣故。

圖3   殼聚糖涂層和殼聚糖載銅涂層處理后硅橡膠樣品的XPS圖譜。

綜合上述結果，聚多巴胺-戊二醛-殼聚糖載銅涂層的C元素的分峰擬合譜圖與聚多巴胺-戊二醛-殼聚糖涂層中C元素的分峰擬合譜圖的形狀沒有明顯的不同，說明在殼聚糖與銅配位螯合過程中C原子的化學環境沒有變化[23,24]。如圖3g N元素的分峰擬合結果所示：配位后N元素有4種存在形式，其結合能分別為396,396.7,397和398 eV。與圖3c中聚多巴胺-戊二醛-殼聚糖涂層的N元素分峰擬合結果相比，在398 eV處出現一新峰，與其它N1s結合能相比增大了1~2 eV,表明在接枝過程中有明顯的失電子傾向。圖3h給出了O元素的分峰擬合結果，可見配位后O元素有5種存在形式，對應的結合能分別為528.4,529,530,530.5和531eV。與配位前殼聚糖中O元素的精確譜相比，在528.4eV出現一個新峰，與其他O1s結合能相比增加了0.5eV,表明O元素也有失電子傾向。CuSO4中Cu2+的結合能是單一的，位于935.6 eV。從圖3e可見，與殼聚糖螯合的Cu元素有3種存在形式，分別對應的結合能是951、941和931 eV,其中結合能為931 eV的Cu2+在配位過程中有得電子傾向。結合殼聚糖分子鏈上N元素結合能的變化，可以認為這部分Cu2+與殼聚糖的氨基是通過配位鍵結合的，據此可推斷Cu2+的結合能為941 eV是其與殼聚糖上的羥基配位所致。結合能為951 eV的Cu2+,為未參與螯合的銅離子。

2.4 涂層的表面形貌

為了研究預處理對涂層結合力的影響，對比了經預處理前后樣品的表面形貌。如圖4a和b所示，直接在硅橡膠表面制備功能化涂層，涂層物質在樣品表面局部聚集且有明顯的翹起。圖4d和e給出了經多巴胺/戊二醛預處理后制備的功能化涂層形貌，可見涂層在樣品表面分布均勻，沒有翹起，表面有均勻的凸起，較平整。圖4e-給出了涂層截面厚度測量圖，可見涂層的平均厚度為5.06 μm。將涂層處理后的樣品在生理鹽水（0.9%NaCl）中浸泡3 d,觀察涂層表面形貌變化以評價結合性能。圖4c給出了未經預處理樣品浸泡后形貌，可見表面涂層發生脫落；圖4f給出了經多巴胺/戊二醛預處理后制備的功能化涂層樣品浸泡后形貌，可見涂層均勻，沒有明顯的脫落，在浸泡液中也未見脫落的涂層物質。

圖4   用不同預處理工藝涂層處理后樣品的形貌

2.5 涂層的抗菌性能

圖5給出了金黃色葡糖球菌（S. aureus）分別在殼聚糖涂層和殼聚糖載銅涂層上的粘附狀態。如圖5a和b所示，S. aureus在殼聚糖涂層表面黏附數量較多，呈聚集狀態，局部已形成生物膜。如圖5c和d所示，S. aureus在殼聚糖載銅涂層表面只有少數細菌分布。細菌在載銅涂層表面沒有聚集，也就沒有形成生物膜。這些結果表明，殼聚糖載銅涂層具有明顯的抗菌功能，并且降低了細菌在涂層表面的附著力。這也表明，涂層與硅橡膠基體結合良好。

圖5   涂層處理后樣品表面金黃色葡糖球菌黏附形貌

3 討論

針對植入性醫療器件在長期植入過程中的感染問題，本文將化學接枝法增強抗感染涂層與硅橡膠類器件結合，實現了器件的功能性。鑒于多巴胺在不同材料上的強力粘附特性，本文用多巴胺對具有疏水性的硅橡膠進行預處理，引入活性基團OH和NH2,隨后通過戊二醛偶聯引入醛基，最終將殼聚糖載銅涂層與硅橡膠基體以化學鍵的形式結合。圖1中的XPS結果表明，通過多巴胺聚合引入了N元素。根據圖6中多巴胺的聚合機理圖可以推斷，引入的部分N元素以NH2的形式存在的，為后續的化學接枝反應提供了活性官能團。隨后，經戊二醛偶聯后，圖1e中N1s分峰結果顯示出現了N=C峰，表明聚多巴胺與戊二醛形成了新的化學鍵。以上預處理工藝不僅為后續的化學接枝提供了活性官能團，還影響硅橡膠表面的浸潤性。硅橡膠本體為疏水性材料，其水接觸角為110.3°，經多巴胺預處理后接觸角下降到79°。由于液體在固體表面鋪展的能力或傾向性受固體材料表面能、表面粗糙度以及表面微結構的影響[27],通過化學接枝法改變硅橡膠基體的表面能使硅橡膠基體的表面能降低。此外，聚多巴胺在硅橡膠表面的粘附使硅橡膠表面的微觀結構發生了變化，從另一個角度改善了水溶性溶液在硅橡膠表面的鋪展性。

圖6   多巴胺在水溶液中的自聚反應[25]和聚多巴胺自聚反應機理[26]

殼聚糖載銅功能化涂層溶液為水溶性溶液，因此涂層溶液在經多巴胺和戊二醛兩步預處理后的硅橡膠表面的鋪展性明顯改善。根據浸潤吸附理論，高聚物的黏結作用分為兩個階段。第一階段：高聚物大分子借助宏觀布朗運動從溶液中移動到被粘物表面，通過微布朗運動大分子鏈節逐漸向被粘體表面的極性基團靠近。第二階段：發生吸附作用。黏結要求達到后，為了進一步改善性能，應改進被粘體對高聚物的浸潤性[28]。根據以上理論，本文用聚多巴胺預處理方法大幅提高了功能化涂層溶液在硅橡膠基材上的浸潤性，從而提高了涂層在基材上的吸附功。經預處理后的硅橡膠，再通過化學接枝法與殼聚糖載銅功能化涂層（殼聚糖作為對照）以化學鍵的形式結合。對比功能涂層制備前后的XPS結果，對N1s進行分峰擬合處理結果表明，有酰胺鍵和亞胺鍵形成。這表明，殼聚糖涂層以化學鍵合的形式成功接枝到硅橡膠表面。采用浸泡法對涂層與硅橡膠基體的結合性能進行評價，對比浸泡前后硅橡膠樣品的表面形貌，表明經多巴胺和戊二醛兩步預處理可有效提高功能化涂層與硅橡膠基體的結合性能。由于涂層厚度對涂層與基體間的結合力影響較大，隨著涂層厚度的增加涂層與基體間的結合性能將減弱。因此，本文用提拉法進行一次提拉制備殼聚糖載銅功能化涂層樣品和對照組的樣品，涂層平均厚度為5.06 μm。

細菌粘附實驗結果表明，金黃色葡萄球菌在經一次提拉制備的殼聚糖載銅功能化涂層樣品表面的粘附明顯少于對照組的殼聚糖涂層處理的樣品，表明載銅涂層具有殺菌性能。本文選擇殼聚糖涂層樣品作為對照組，旨在突顯載銅涂層的優異抗菌功能。有研究表明：材料表面的親/疏水性影響細菌、真菌和蛋白的粘附[29]。Duncan Hewitt還指出[30],疏水作用是影響大多數致病原粘附的主要驅動力。還有學者報道，材料表面親水性的提高可有效減少材料與蛋白質的接觸和非定向結合，從而減少污染物在材料表面的吸附沉積[31]。本文使用的功能涂層為水溶性溶膠物質，得到的功能涂層為親水涂層，從而使硅橡膠的親水能力增強，在一定程度上降低了細菌在涂層表面的粘附傾向。制備功能化涂層，一方面提高了硅橡膠表面的親水性，降低細菌在材料表面的粘附；另一方面，涂層中的銅具有高效的殺菌作用，這種雙重作用使硅橡膠表面細菌的粘附能力降低。根據本文的研究結果和理論推斷，殼聚糖載銅功能化涂層能有效降低硅橡膠導管發生感染的幾率。當然，殼聚糖載銅涂層的抗菌性與涂層中所載銅離子的含量呈正相關。

4 結論

（1） 在硅橡膠表面制備聚多巴胺仿生涂層，可改變其表面微結構并提高表面粗糙度，聚多巴胺中大量的氨基官能團可提高表面的浸潤性。

（2） 用逐步化學接枝方法在材料表面構建活性位點，與涂層材料進行化學鍵合，可提高涂層與硅橡膠基體間的結合強度，從而使硅橡膠具有良好的抗感染功能。

（3） 改性后的醫用硅橡膠導管具有良好的抗菌功能，導管表面的涂層能經受長期浸泡，可應用于臨床。