生物活動所引起的腐蝕和污損已被公認為是引起海洋鋼鐵構筑物諸如石油平臺、管線、碼頭、船舶等腐蝕破壞的重要原因，給海洋工程的安全服役帶來嚴重隱患，并造成巨大的經濟損失。根據侯保榮院士主持的中國工程院重大咨詢項目的調查報告，2014年我國的腐蝕總成本約占當年國民生產總值的3.34%,總額超過2萬1千億元人民幣。其中，海洋腐蝕損失約占總腐蝕損失的1/3。

    潔凈的材料浸入海水后，在數秒到更長的時間內，水中的有機分子、微生物以及其他海洋生物會陸續在其表面附著。這一過程通常可劃分為4個階段，即形成條件層、微生物附著形成生物膜、軟體宏觀污損和硬體宏觀污損。在整個過程中，海洋生物與材料表面發生復雜的物理化學作用，引發嚴重的微生物腐蝕和生物污損問題。

    海洋材料表面微生物的附著、生長、繁殖、代謝、死亡等過程中所產生的物質直接或間接對材料造成的腐蝕稱之為微生物腐蝕。統計表明，與海洋微生物附著有關的材料破壞占到涉海材料總量的70%~80%。微生物的存在可顯著增大腐蝕速率，以碼頭中鋼結構為例，微生物腐蝕引起的腐蝕速率最大可達4 mm/a,平均腐蝕速率也達0.3 mm/a。

    海洋生物在船體或水上設施表面的附著積累稱為海洋生物污損，這是人類自開發利用海洋以來就面臨的難題。生物污損的危害主要表現在降低船舶航速、影響海洋工程設施的安全運轉、增加燃料消耗、阻塞隔膜管道、增加有害氣體排放、危害水產養殖業等。

    近年來眾多學者對中國近海碼頭，如旅順港、青島港、洋山港、廈門港、大亞灣碼頭、廣西白龍碼頭等污損生物的群落結構及多樣性進行了調查。結果表明，不同碼頭優勢污損生物種類和數量不同，主要優勢污損生物有柄海鞘、苔蘚蟲、紫貽貝、大型海藻、牡蠣、中胚花筒螅、泥藤壺、白脊藤壺、僧帽牡蠣等，但是以上這些調查均針對宏觀污損生物。

    目前，對于實海掛片微生物的調查情況國內已有一定的報道。林燕順等在廈門港進行冬季掛片，顯示掛片1 h的不銹鋼片上有細菌出現，掛放24 h后附著細菌絕大多數為革蘭氏陰性球菌或短桿菌，主要有7種好氧優勢菌，包括假單胞菌屬、黃單胞菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、黃桿菌屬、微球菌屬等；掛放7 d后整個試板表面已覆蓋有其他形態生物的復雜群落。吳進怡等[11]報道了海口海水中25鋼片銹層中的微生物主要包括假單胞菌、弧菌、鐵細菌、硫桿菌及硫酸鹽還原菌 （SRB） 等；于洋等報道了煙臺近海聚氯乙烯 （Poly vinylchloride,PVC） 板掛片上的微生物主要有假交替單胞菌、芽孢桿菌、鹽單胞菌、嗜冷桿菌、腸桿菌等。以上研究標志著人們開始關注實海掛片微生物，不足之處在于研究多集中于某個海域的全浸區，而對不同海域不同腐蝕區帶掛片樣品銹層中微生物的對比調查卻少有報道。

    本實驗選擇實際應用的海洋工程材料Q235碳鋼，分別于黃海 （青島）、南海 （三亞） 海域的不同腐蝕區帶 （潮差區、全浸區） 進行實海掛片，采用傳統的分離培養法和16S rDNA序列分析技術，從其銹層中分離獲得可培養的微生物。并對比分析不同時空下全浸區、潮差區細菌種類的差別，為后續微生物腐蝕研究菌種的科學選擇提供基礎。

    1 實驗方法

    1.1 樣品規格及處理

    實驗中所用掛片試樣為200 mm×100 mm×5 mm的Q235碳鋼，其化學成分 （質量分數，%） 為：C 0.18,Si 0.02,Mn 0.45,S 0.02,P 0.03,Fe余量。試樣用砂紙逐級打磨至800#,并打孔標記。所有試樣在掛片前分別經丙酮去油、酒精脫水和干燥處理。將試樣分別掛在鋼鐵研究總院青島腐蝕研究所小麥島實驗站和中國中船重工七二五研究所三亞腐蝕實驗站的潮差區和全浸區，掛片時間為90,180和270 d。

    1.2 腐蝕速率的計算

    用硬毛刷除去試樣表面的腐蝕產物，按照GB/T16545-2015規定的方法，采用含六次甲基四胺的HCl水溶液去除試片上的腐蝕產物后，再用去離子水沖洗，并用無水乙醇清洗后吹風機冷風吹干，放入干燥器中衡重。稱重后與掛片前相比，計算出掛片的腐蝕失重與腐蝕速率。

    1.3 腐蝕產物的分析

    為研究銹層的組成，使用潔凈刀片刮取試片表面的腐蝕產物，烘干后研缽研成粉末。將所得樣品放入真空干燥器以備進行X射線衍射 （XRD） 分析 （UitimaIV型，CuKα射線，掃描速率10°/min,掃描范圍5°~80°），判定其組成。

    1.4 銹層內微生物的獲取

    達到掛片時間的樣品，取樣時先用數碼相機拍照，盡量不要碰掉銹層，放置在干凈、裝海水的食品袋中，轉移至實驗室。在實驗室無菌超凈臺內進行可培養微生物的分離，用事先滅菌的海水沖洗表面盡可能去除環境中的細菌。用鑷子刮取銹層表面及內部，并用無菌海水沖洗銹層，獲得微生物分散液。

    1.5 腐蝕與污損微生物的分離

    將盛有銹層微生物分散液的燒杯，用無菌槍頭盡量吹打混勻。按照10倍梯度稀釋的方法，將混合液進行稀釋，然后分別將稀釋10,100及1000倍3個梯度的稀釋液涂布于事先準備好的2216E、檸檬酸鐵銨平板培養基 （成分與用途詳見表1）。并采用GB/T14643.5-93中規定的方法以特定培養基進行厭氧菌SRB的分離。將涂布平板放置在30 ℃恒溫培養箱培養24~72 h。

    1.6 微生物的純化

    2216E平板一般生長24~48 h即有明顯的單菌落，檸檬酸鐵銨培養基一般要達到72 h以上才有明顯菌落生長，將平板上明顯的單菌落進行三區劃線培養于對應的培養基。重復2~3次，確保所獲得菌株為純培養后，再擴大培養并保存菌株。

    1.7 微生物的鑒定

    對分離純化的菌種進行聚合酶鏈式反應 （PCR），首先取100 μL菌懸液，10000 r/min離心2 min后，去除培養基再加入80 μL的無菌水，吹打混勻后水浴煮沸10 min,再次離心即獲得模板。使用16S rDNA的一對通用引物1492R/27F進行菌落PCR,將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到目的條帶約在1400bp的產物送去青島擎科梓熙生物技術有限公司測序，將測序結果在NCBI BLAST進行序列比對得到鑒定結果。

    2 結果與討論

  2.1 掛片樣品腐蝕形貌觀察

    圖1和2給出了Q235碳鋼實海掛片180 d的部分代表性形貌圖。可以看出，180 d后試樣的表面完全被腐蝕產物覆蓋。圖1中青島掛片樣品腐蝕產物顏色偏磚紅色和棕色，而圖2中三亞掛片樣品腐蝕產物顏色偏黑紅色且掛片樣品伴有泥沙。兩個海域全浸區掛片樣品外層形成了疏松的腐蝕產物層，內層呈黑色淤泥狀；潮差區銹層較厚，出現裂紋，海水中Cl-等腐蝕性離子迅速透過裂紋與基體接觸，促使腐蝕速率增加。且在銹層中微生物的分離實驗過程中，全浸區腐蝕產物易脫離試樣表面，潮差區腐蝕產物很難剝離。

    2.2 掛片腐蝕失重分析

    不同時空下不同腐蝕區帶Q235碳鋼實海掛片平均腐蝕速率見表2。可以看出，各海域不同腐蝕區帶平均腐蝕速率有所差別，相同掛片時間下潮差區的均高于全浸區的 （約高出2倍）。這一結果與朱相榮等報道結果一致。

    本實驗掛片起始時間為4月份，掛片周期為90和180 d,所得到的平均腐蝕速率相較于已報道的長期腐蝕數據偏大。以青島海域為例，朱相榮等報道的Q235碳鋼在全浸區、潮差區掛片1 a的平均腐蝕速率分別為0.19和0.22 mm/a;夏蘭廷等報道的Q235碳鋼掛片4 a的平均腐蝕速率在全浸區為0.13~0.14、潮差區為0.12~0.18 mm/a。這一偏差的出現與實海掛片腐蝕速率隨時間的延長而減緩的普遍規律相一致。

    2.3 腐蝕產物成分分析

    青島實海潮差區掛片180 d腐蝕產物外層成分復雜，主要有Fe3O4,α-FeOOH和γ-FeOOH,其中γ-FeOOH是主要成分 （圖3a）。這與鄒妍等報道Q235碳鋼在海水中浸泡126 d時，外銹層主要是由γ-FeOOH組成的結果相一致[15]。內層腐蝕產物主要是Fe3O4和α-FeOOH。掛片180 d全浸區腐蝕產物外層主要是Fe3O4,α-FeOOH和γ-FeOOH,內層主要是Fe3O4 （圖3b）。這與García的理論相一致，即越靠近金屬表面溶解氧的含量越少，越有利于Fe3O4的形成，因此Fe3O4總是在靠近金屬表面的區域形成。

    與青島海域掛片結果相似，三亞實海潮差區和全浸區掛片6個月外層腐蝕產物主要成分也為Fe3O4,α-FeOOH和γ-FeOOH;同時，Fe3O4在內層腐蝕產物中占比大 （圖4）。因此，在青島和三亞海域Q235碳鋼腐蝕產物成分差別不大。

    2.4 掛片銹層內SRB分離結果

    SRB是最為典型的腐蝕微生物。依照最大可能計數法 （MPN法） 的結果 （表3），不同時空下Q235碳鋼實海掛片全浸區銹層內均檢測到SRB,而潮差區銹層內均未檢測到SRB。附著在金屬表面的海洋生物阻礙了O的擴散，有利于減緩金屬的腐蝕，但這層覆蓋物中的好氧細菌能耗盡溶解氧成為生化障礙層，在金屬表面形成厭氧環境，為SRB提供良好的生長繁殖條件，從而加速金屬的腐蝕。這也是本實驗在全浸區可以檢測到SRB的主要原因，全浸區可形成SRB生存的厭氧條件；而潮差區一直處于干濕交替狀態，加上O2含量較為豐富，不利于SRB的存活。

    2.5 掛片銹層內鐵細菌分離結果

    鐵細菌 （IOB） 是生活在含有高濃度Fe2+的池塘、湖泊、沼澤、污水排放管道、溫泉等水域中，能將二價鐵鹽氧化成三價鐵化合物，并能利用此氧化過程中產生的能量來同化CO2進行生長的細菌的總稱[20]。IOB是參與Fe的氧化以及這些元素可溶性氧化物的沉淀過程的一類微生物,具有使Fe的氫氧化物沉淀的能力，然后Fe3+以Fe（OH）3的形式沉淀下來。有研究表明，IOB在鐵銹的形成過程中發揮重要作用，其能在短時間內產生大量鐵氧化物，并會對碳鋼造成局部腐蝕。研究較多的鐵細菌是生活在好氧或微好氧環境中的球衣菌屬、纖發菌屬、泉發菌屬、嘉利翁菌屬和假單胞菌屬等。

    表4為Q235碳鋼實海掛片銹層內分離鐵細菌的情況。對比可見，三亞海域分離得到的鐵細菌種類高于青島海域，且全浸區較潮差區更易分離到鐵細菌。已分離鑒定的鐵細菌主要集中在弧菌屬 （Vibrio sp.）、交替單胞菌屬 （Alteromonas sp.）、假單胞菌屬 （Pseudomonas sp.）、芽孢桿菌屬 （Bacillus sp.）、節桿菌屬 （Arthrobacter sp.）、希瓦氏菌屬 （Shewanella sp.） 等12個屬內。Zakharova等從貝加爾湖沉積物中分離得到19株鐵細菌，主要屬于鞘鐵細菌、瑙曼氏菌屬、芽孢桿菌屬3個屬。Ashassi-Sorkhabi等從下水道污水處理裝置中分離到2株鐵細菌，分別是大頭茶屬和腸桿菌屬。Xu等從循環冷卻水系統分離到一株鐵細菌為球衣菌屬。與以上研究結果對比，可見不同海域不同分離物中鐵細菌的種類差別較大。

    2.6 掛片銹層中優勢好氧/兼性厭氧微生物分離

    結果目前大多學者都是對銹層中的SRB,IOB,硫氧化菌 （SOB） 等進行研究,而本實驗除了對SRB和IOB等腐蝕性細菌進行分離外，還對銹層內優勢好氧/兼性厭氧菌進行了分離鑒定。結果顯示其主要集中Vibrio sp.、Pseudoalteromonas sp.、Bacillus sp.、產微球莖菌屬 （Microbulbifer sp.）、交替單胞菌屬 （Alteromonas sp.）、發光桿菌屬 （Photobacterium sp.）、黏著桿菌屬 （Tenacibaculum sp.）、紅細菌科 （Rhodobacteraceae）、黃桿菌科 （Flavobacteriaceae）、α-變形桿菌 （Alpha proteobacterium）、腸桿菌屬 （Enterobacter sp.）、赤桿菌屬 （Erythrobacter sp.） 等20余個菌屬中 （表5）。弧菌屬細菌主要有溶藻弧菌 （Vibrio alginolyticus）、副溶血弧菌 （Vibrio parahaemolyticus）、以溶珊瑚弧菌 （Vibrio coralliilyticus）、強壯弧菌 （Vibrio fortis）、查氏弧菌 （Vibrio chagasii） 等。假交替單胞菌屬主要包括藤黃紫假交替單胞菌 （Pseudoalteromonas luteoviolacea）、殺魚假交替單胞菌 （Pseudoalteromonas piscicida）、Pseudoalteromonas phenolica、Pseudoalteromonas rubra等。全浸區分離的細菌種類均高于潮差區分離的。

    通過對比可見，本實驗以弧菌屬、假交替單胞菌屬、芽孢桿菌屬為優勢菌。與吳進怡等認為45鋼銹層中的微生物主要是由假單胞菌、弧菌、鐵細菌、硫桿菌和SRB組成；楊雨輝等通過實驗箱進行掛片分離到熱帶自然海水 （海南海口） 中需氧菌及兼性厭氧菌主要由假單胞菌屬、弧菌屬、黃桿菌科等細菌組成相比較，相同之處弧菌都是優勢菌。其他結果不一致的原因可能是雖同為南海海域，但不同試驗點 （三亞、海口） 以及室內實驗條件和自然條件下受到季節、氣候、波浪、海流及污染等的差異造成銹層內微生物優勢種類的不同。此外，與掛片所用的材料 （45鋼、Q235碳鋼） 也有關系。

    欒鑫等用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應 （PCR-RFLP） 方法研究青島近海實海全浸1 a的Q235碳鋼內銹層細菌的多樣性，認為銹層中優勢菌為α-變形菌綱，主要包括玫瑰桿菌屬、赤桿菌屬、中慢生根瘤菌屬、α-變形菌等種類，這與本文中同樣在青島掛片分離到的紅細菌科屬于α-變形菌綱，以及赤桿菌屬和α-變形菌屬等鑒定結果有相同之處，但是大部分菌種不同，原因可能與分離方法及掛片周期不同有關。

    在本實驗中，Pseudoalteromonas sp.在不同時空下不同腐蝕區帶均可以分離得到，這與呂建福等報道的假交替單胞菌屬是海洋潮差區和浪濺區混凝土表面的優勢菌結果相一致。鑒于該菌是實海掛片銹層中普遍存在的微生物，本課題組已經開展了關于其與腐蝕機理相關方面的研究。

    根據實驗結果，不同海域的微生物種類差異較大，但優勢種類多數集中在弧菌屬、芽孢桿菌屬、假交替單胞菌屬等。這些種屬主要分布在海水、底泥及銹層中，因此在進行防污殺菌實驗時可以有針對性的選擇此類在海水環境中廣泛存在的微生物為研究對象。

    目前，關于傳統的涂板方法結合16S rDNA序列分析的方法分離實海掛片可培養微生物方面的報道不多，平板分離法分離到的可培養細菌多樣性研究不能完全覆蓋到樣品中所有菌群。但是，該方法不僅可以大致了解環境樣品中細菌群落結構，還可以得到菌種，為后續研究工作提供支持。由于實驗條件的限制，本文所獲得的可培養細菌可能只是Q235碳鋼銹層內細菌資源的一小部分，通過對培養基成分、培養時間和培養溫度的優化可分離得到更多的細菌資源。本實驗所獲得的菌株對于后續腐蝕及污損微生物的篩選提供了一定的菌種庫，為后期開展腐蝕機理研究的實驗提供了良好的菌種保證。

    3 結論

    （1） Q235碳鋼在不同海域不同腐蝕區帶的腐蝕速率不同，且隨時間的延長腐蝕速率均降低，潮差區的腐蝕速率總是大于全浸區的。銹層可分為內銹層和外銹層，外銹層由Fe3O4,α-FeOOH和γ-FeOOH等組成，內銹層主要含Fe3O4;青島和三亞海域的腐蝕產物成分差別不明顯。

    （2） Q235碳鋼在不同時空下不同腐蝕區帶掛片腐蝕產物中的細菌群落結構復雜，主要包括SRB、鐵細菌和好氧/兼性厭氧菌等。全浸區銹層中分離的細菌種類和數量存在差異均多于潮差區的，且更易檢測到SRB存在。好氧/兼性厭氧菌種類豐富，以弧菌屬、芽孢桿菌屬、假交替單胞菌屬為優勢菌。

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責任編輯：韓鑫

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