石墨烯及其衍生物被譽為“奇跡”材料，在電子、儲能、醫藥等社會各個領域有著廣泛的應用。談石墨烯的安全性，有些讀者可能感覺到奇怪，但如果有一天石墨烯真的被大規模應用，它將無處不在。隨著各類石墨烯基材料（GBMs）被不斷開發，其對人類健康和環境的潛在影響一直缺乏合理的綜合評價。有鑒于此，瑞典環境醫學研究所Bengt Fadeel，曼徹斯特大學Cyrill Bussy，的里雅斯特大學Maurizio Pra教授和法國斯特拉斯堡大學Alberto Bianco等26位海外學者聯名在國際頂級期刊《ACS Nano》上發表綜述文章。在本文中，作者討論了GBMs材料的合成和表征，并且使用體外和體內模型系統評估GBMs對人類和環境的危害，解開了GBMs材料的結構-活性關系。

    【引言】

    石墨烯是首個被發現的二維原子晶體，具有許多超凡的性能，如機械剛度、強度和彈性，以及高電導率和熱導率，其衍生物目前也擁有多種不同的應用。安全與可持續發展石墨烯技術和產品需要密切關注材料對人類健康和環境的潛在影響，事實上，安全評估是材料走向應用的一個重要組成部分。

    材料表征是危害評估的關鍵要素，碳納米管的毒理學評估就是一個很好的例子——碳納米管在某種程度上作為病原纖維，對人類具有潛在致癌性。當然，如果適當純化并加以表面修飾，碳納米管在納米醫學，例如藥物或基因傳遞和/或成像方面具有廣闊的前景。從以往的經驗教訓來看，如果我們承認新材料具有有用的特性，我們就必須承認，這種新材料可能帶來新的或未預料到的風險。這并不是說新材料的生物或毒理效應必然是“新奇的”，但我們需要了解這些材料的特性以及它們如何與生物效應相互作用，以便使它們既實用又安全。

    【GBMs的合成與表征】

    石墨烯研究中的一個重要問題是， “石墨烯”作為術語可以描述許多不同的GBM。為了補救這種情況，Graphene旗艦公司提出了一個GBM的分類方案，考慮三個關鍵參數：石墨烯層數、平均橫向尺寸和碳氧原子比（C:O）。使用這種分類可促進不同實驗室在研究之中的比較。

    Figure1.石墨烯材料的分類

    GBMs的合成

    雖然文獻中有許多關于不同石墨烯合成方法的報道，但是當材料用于生物應用包括毒理學評價時，需要滿足某些特定要求。一般來說，對于體外研究，材料必須在水溶液中穩定分散，并且雜質的量應仔細控制，因為生產通常不在無菌條件下或使用無菌溶劑進行，所以除了合成過程中產生的化學污染物外，還需要考慮生物污染物，即微生物或部分微生物（內毒素）的影響。常見獲得GBM用于生物應用的方法有：

    1. 超聲剝離法；為了成功地在水中剝離，通常使用層間的小分子或溶劑的輔助插層。比如Liu et al.采用過硫酸銨或過氧化氫插層法，在微波輻照下使石墨剝落，制備出高質量的多層石墨烯。

    2. 氧化石墨烯（GO）；大多數合成GO的方法是基于石墨氧化，也就是著名的Hummers法，其中包括使用氧化試劑和酸。這種方法會產生不同程度的氧化和雜質，必須引入額外的純化步驟以提高材料的純度。

    3. 還原氧化石墨烯（rGO）；獲得rGO的代表方法包括GO的化學、熱和電/光化學還原。化學還原法優于非化學還原法，因為提高了質量、效率和可以獲得穩定的rGO分散液。最有效的化學還原劑是肼，然而，這種試劑不是很受歡迎，因為它對人類和環境具有毒性。

    盡管上面討論的大多數合成方法都獲得了高質量的石墨烯，但是這些方法無法定標，限制了它們的工業應用。因此，以簡單和低成本的方式獲得大量的生物相容性石墨烯仍然是一個相當大的挑戰。

    GBMs的表征

    為了進行適當的危險評估，需要使用標準化的技術對材料進行良好表征。對于化學表征，最常用的技術是XPS、FT-IR、Raman、XRD、TGA和元素分析，TEM、SEM和AFM提供了材料的形態和尺寸的信息，阿米巴裂解液（LAL）檢測通常用于檢測納米材料和生物材料中的內毒素含量。值得注意的是，即使使用普適性方法制備出石墨烯材料（例如，GO），最終產品通常也不是均勻的，而是具有不同性質的組分廣泛分布。通常，GBMs的毒性（或安全性）取決于物理化學性質，如大小、層數和表面化學性質，此外，雜質的存在和所使用的石墨烯合成方法也可能影響毒理學反應。

    FigureS1.根據石墨烯層數、平均橫向尺寸、原子碳/氧比三個基本性質對最近石墨烯研究中使用的GBM材料進行分類

    材料屬性的作用：參考數據庫

    為了剖析（納米）材料特性在生物學影響方面的作用，應該考慮訪問適當的參考數據庫。2009年，Nel提議建立一個標準的納米材料數據庫，包括納米材料和納米顆粒的主要類別，他的原話是“it is important to linkthe library development to a nanomaterial classification that allows toxicologicalmechanisms to be interpreted in terms of intrinsic material properties”。從那時起，出現了一些數據庫，Zhou et al.開發了80個功能化碳納米管的組合數據庫，以揭示與細胞毒性和免疫應答有關的結構-活性關系。石墨烯與碳納米管和富勒烯一起被包含在納米碳的家族中。然而，我們認為，由于石墨烯的化學結構與納米管和富勒烯的化學結構顯著不同，因此化學成分不是人們應該考慮的唯一參數。

    【石墨基材料的生物分布】

    GBMs在暴露有機體中的命運受其內在物理化學特征（如橫向尺寸、厚度和C:O比/官能化）以及它們與生物環境接觸時的外在或后天獲得的特征的支配，此外，進入身體的入口也是物質隨后命運的主要決定因素。GBMs的內在特征可影響其生物分布、向次生器官的轉移、積累、降解和清除，然而，這些特性可能由于生物環境中存在的蛋白質和其他生物分子的吸附而改變。值得注意的是，隨著GBM從一個生物隔室移動到另一個生物隔室（例如，從肺部移動到血流），這些獲得的特征可能隨時間動態變化，并隨著局部環境的變化而演變。然而，由于免疫細胞或其他形式的生物轉化的降解，固有材料特性也會發生變化。

    石墨烯基材料的多種染毒途徑

    為了探討口服給藥的影響，Zhang et al.采用125I標記的小和大（兩種納米級）rGO片在口腔灌胃后60天內的生物分布，這兩種物質都存在于血液、心臟、肺、肝臟和腎臟中，腎臟中的含量在第一天顯著高于對照組，隨后迅速減少，但在第15天和第60天仍高于對照組，這些結果表明，兩種物質在胃腸道內迅速被吸收，并通過體循環到達次級器官。Li et al.采用125I標記的納米GO（橫向尺寸：10-800nm，1-2層）測定氣管內灌注后的生物分布，絕大多數的GO在肺中發現，在血液、肝臟和腎臟中也檢測到少量。這些結果歸因于直接從肺或通過腸道吸附向血液的轉移，因為大量物質也可在胃和腸中檢測到，可能是由于粘液毛清除、吞咽和再分布到胃腸道。

    納米安全與藥物的橋接：靜脈給藥

    納米材料在生物醫學應用中最常見的給藥途徑之一是靜脈（IV）途徑，納米醫學中大量的研究和開發工作已經證實，形狀、尺寸和表面電荷是決定納米材料在靜脈注射后的生物分布和命運的最重要的物理化學參數。

Figure2.GO的生物分布 [64Cu]-f-GO-thin, [64Cu]-f-GO-thick和[64Cu]-EDTA的PET/CT表征結果和組織分布

    總的來說，證據表明GBM能夠跨越生理屏障，到達遠離進入點的次級器官，然而，由于缺乏已發表的數據和缺乏系統的調查，就GBM的物理化學特征和生物分布模式之間的關系得出確定的結論還為時過早。

    【石墨基材料的危險性評估】

    納米材料可以通過不同的途徑進入人體，而吸入、皮膚吸附和攝取是最有可能在環境中意外感染的途徑，在某種程度上，這些物質在特定靶器官的水平上表現出它們的生物學（或毒理學）效應。

    石墨烯基材料的免疫相互作用免疫系統由復雜的分子和細胞網絡組成，它們保護我們的身體免受感染和其他外源物質的侵害，同時保持對自身成分的耐受性。在新材料的開發中，評估它們對免疫系統的影響是至關重要的，以便了解這些材料的存在是否能夠被處理，或者弄清這些材料的持續存在是否會引起慢性疾病。巨噬細胞是固有免疫系統的關鍵細胞，其作用是清除外源性和內源性物質，因此，探究GBMs是否影響巨噬細胞的存活和/或活化是非常重要的。

Figure3.巨噬細胞攝取GO的過程

    巨噬細胞屬于病原體或外來物質的天然免疫防御的前線，大多數關于巨噬細胞的研究都是用巨噬細胞樣細胞系或單核細胞來源的巨噬細胞來完成的，然而，肺泡巨噬細胞連同上皮細胞，在肺部暴露后與到達肺部的GBM相互作用。

    由于石墨烯的疏水性太強，在水溶液中不能得到均勻的分散體，因此必須使用合適的生物相容性表面活性劑或涂覆分子。高通量技術徹底改變了免疫細胞的分析及其復雜的相互作用，因此，只有通過采用系統生物學方法和高通量工具，才能夠對免疫系統如何與納米材料相互作用進行全面的分析，從而能夠對細胞類型、細胞激活狀態和可溶的刺激/抑制介質進行多重分析。

    Figure4.用單細胞質細胞儀分析石墨烯的免疫影響

    總的來說，當對GBMS的不同研究結果進行比較時，發現與碳納米管的作用相比，這類材料對巨噬細胞的毒性似乎不太明顯。

    石墨烯基材料的生物降解

    納米材料的生物降解是毒理學和納米醫學的一個相當重要的課題，一些碳基納米材料，如單壁碳納米管，很容易被免疫細胞降解。雖然在這方面已經對GBM做了一些研究，但是描述每個生物降解研究中使用的不同材料的結構特征使結果不太合理。Kotcheyet al.發現低濃度過氧化物酶（HRP）可降解GO，而rGO則不受影響，該文章評價了三種橫向尺寸和碳氧比相近，但厚度不同的GO，在24h時，兩種高度分散的材料完全或幾乎完全降解，而聚集的樣品僅發生有限的結構變化。

    石墨烯基材料對皮膚的影響

    皮膚是人體和環境之間的主要屏障，它可以被認為是GBMs最重要的暴露部位之一，尤其是在環境中，考慮到GBMs的化學性質，皮膚刺激可以被認為是皮膚暴露后最可行的結果。然而，不能根據GBMs與蛋白質相互作用的傾向排除皮膚致敏作用，事實上，皮膚接觸相關材料如石墨和碳納米管，很容易形成皮膚疾病，如接觸性皮炎。

    石墨烯基材料對肺的影響

    在環境中無意接觸納米材料的不同途徑中，吸入是最受關注的途徑，關于空氣污染和超細顆粒對人類肺部健康的影響的長期研究支持了納米和微米顆粒可能對肺部造成損害的觀點。經過長期的研究，科學家發現肺感染的程度與被測材料的特定理化性質直接相關，尺寸似乎再次成為GBMs生物反應的重要驅動力。值得注意的是，迄今為止只有少數研究報告在肺部暴露于GBMs后誘導纖維化，當GBMs與致病性多壁碳納米管進行比較時，肺纖維化的缺乏是一個重要的差異。

    石墨烯基材料對心血管的影響

    在過去的20年里，有大量的證據表明空氣污染、吸入細微粒和超細微粒引起心血管疾病，吸入顆粒物引起的肺系統的炎癥和氧化應激被認為是對心血管系統產生副作用的可能原因。心血管疾病的發生可以和肺部感染之間聯系起來，但當前的研究都不太系統，缺乏合理的結論。

    石墨烯基材料對胃腸道的影響

    胃腸（GI）系統使人體能夠攝取食物，消化食物和必需微量元素，以及排出糞便；口腔暴露處潛在的納米材料有兩個主要來源：i）食品中直接攝入的物質或從食品包裝中釋放出來的物質；ii）吸入材料的間接攝入。大部分吸入的納米材料被困在呼吸系統，并通過粘液纖毛向上輸送，最后被吞下或咳嗽出來，而進入胃腸道的納米材料隨之暴露于唾液中。消化酶、pH值、離子強度、表面活性化合物和食物攝取量等若干因素有可能改變納米材料的理化性質，因此在口服GBMs納米材料的危害評估中必須考慮這些因素。

    Figure5.碳基納米材料與腸道微生物

    在這個相對較新的領域進行的首次探索性研究顯示，幾種不同的GBM對腸上皮細胞沒有或僅有輕微的急性細胞毒性，然而，該領域還處于起步階段，GBMs的長期影響，包括對微生物的影響，至今仍未得到答案。

    石墨烯基材料對生殖和發育的影響

    孕婦、胎兒和新生兒是最脆弱的人群，因此在GBM危險評估方面值得特別關注，在懷孕期間，發生的生理變化會影響顆粒動力學和隨后的生物效應，且由于生理變化或免疫系統的不成熟，發育中的胎兒和新生兒比成人更容易受到外來生物的毒性作用。

    石墨烯基材料對中樞神經系統的影響

    石墨烯在神經科學中具有令人振奮的前景，其獨特的物理化學性質，如高導電性、透明性或柔韌性，使得它成為設計具有優異神經調節治療的有吸引力的候選材料，也是中樞神經系統（CNS）損傷的神經再生的必要條件。神經病學是按需釋放藥物，從而能夠精確定向給藥以滿足不同治療應用的要求，基于石墨烯的多功能神經裝置是通過注射或植入將腦細胞和神經元回路直接暴露，因此石墨烯及其衍生物的安全性評估是至關重要的。

Figure6.石墨烯與神經元的相互作用

    Figure7.石墨烯對神經元通訊的調結

    【石墨基材料的環境危害評估】

    雖然納米技術領域獲得了巨大進步，但納米技術對環境影響的理解依然進展緩慢，大規模生產、從富集產物中浸出、工業生產中的意外溢出以及衍生廢物的不良處置可能導致環境中GBMs的顯著釋放和累積。這種現象已經出現在其他合成材料上，例如塑料，它們被發明者和生產者譽為“世紀發現”，并被正確地預測為改變人們的日常生活，然而，盡管承諾實現了，但不幸的是，意外的環境問題抵消了這些好處，而且這些問題是在半個世紀之后才以引人注目的方式出現。因此，探索GBMS的生態毒性具有十分重要的意義。

    石墨烯基材料對細菌的影響

    研究碳基納米材料對細菌的影響是至關重要的，因為它們是環境中營養鏈的基礎，涉及營養循環的許多階段，并與其他生物有復雜的聯系，與其他生物系統相比，GBMs對細菌的影響研究相對比較系統。

    石墨烯基材料對光合生物的影響

    近年來，從藍藻到種子植物，科學家對各種模型和非模型光自養菌進行了GBMs的生態毒性評價。

    石墨烯基材料對種子植物的影響

    作為初級生產者，種子植物是所有陸地生態系統的基本組成部分，空氣分散的GBMs最終會以濕或干沉積形式沉降在植被上，從而到達土壤，種子植物通過食物鏈將吸收的納米材料轉移到生物群。因此，在不同生長階段，從種子到幼苗，GBMs對種子植物的影響已經被研究，在成年植物中更罕見，但通常從細胞培養開始。

    石墨烯基材料對無脊椎動物的影響

    水生和陸生無脊椎動物很可能暴露于碳基納米材料中，對于地面效應，大多數研究是用蠕蟲進行的，特別是線蟲線蟲秀麗隱桿線蟲，這是一種適合于力學研究的模型系統。在水生環境中，生活在水柱中的遠洋物種和生活在沉積物附近或內部的底棲物種會自然地受到碳基納米材料的影響，這取決于它們對遠洋/底棲生物的生物利用度。影響納米材料在環境中的行為的一個重要因素是天然有機材料的存在，這類天然有機材料在自然水環境中普遍存在，比如多糖、脂類、蛋白質及其他有機材料。

    石墨烯基材料對脊椎動物的影響

    生態毒理學中研究最多的脊椎動物是水生幼魚和兩棲類幼蟲，在魚類中，斑馬魚（Danio rerio）模型具有很好的代表性，作為遠洋脊椎動物，盡管在體內觀察到廣泛的生物分布，但是它們可能從胚胎階段就表現出對碳基納米材料的抗性。在胚胎中，GO可以與絨毛膜結合，導致缺氧和孵化顯著延遲，并且觀察到輕微的細胞生長抑制（沒有明顯的凋亡誘導）。對兩棲類幼蟲（Ambyst.mexicanum）進行的研究表明，盡管消化道中大量攝入碳基納米材料，但未觀察到死亡率或生長抑制或任何遺傳毒性。

    Figure8.小層石墨烯、納米金剛石、雙壁或多壁碳納米管對爪蟾幼蟲生長抑制作用的研究

    Figure9.石墨烯生產的生命周期分析，以化學還原法（CRR）和超聲法（USR）為主

    【石墨烯基材料生態毒理學的進一步研究課題】

    使用單一物種的傳統生態毒理學方法信息量很大，需要從生物水平上評估毒性以了解GBMs的潛在毒性，然而，需要更復雜的系統以更接近實際的環境風險評估。尤其是，生物轉化、生物積累和生物放大的概念通常被忽略，盡管它們極其相關，因此，評價納米材料影響的復雜暴露系統，特別是通過利用微型或中型群體作為實驗工具重建實驗營養鏈，正逐漸受到重視。這類系統提供了接近自然生態系統中發現的實驗條件，但它們只允許有限的生物和非生物參數的控制，此外，另一個相關生態毒理學方面的研究相對較少，是“間接”納米毒性的影響，即，納米材料對其他毒性物質或污染物的毒性放大。

    Bengt Fadeel, Cyrill Bussy, Sonia Merino, Ester Vázquez, Emmanuel Flahaut, Florence Mouchet, Lauris Evariste, Laury Gauthier, Antti J. Koivisto, Ulla Vogel, Cristina Martin, Lucia G. Delogu, Tina Bürki-Thurnherr, Peter Wick, Didier Beloin-Saint-Pierre, Roland Hischier, Marco Pelin, Fabio Candotto Carniel, Mauro Tretiach, Fabrizia Cesca, Fabio Benfenati, Denis Scaini, Laura Ballerini, Kostas Kostarelos, Maurizio Prato, and Alberto Bianco, Safety Assessment of Graphene-Based Materials: Focus on Human Health and the Environment, ACS Nano, 2018, DOI:10.1021/acsnano.8b04758.

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責任編輯：王元

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