修復創傷、組織再生甚至器官再生，一直是生物領域科學家努力攻克的難題。盡管人類具有一定的再生能力，例如皮膚、指甲、子宮內膜和肝臟可以自然再生，但是這種能力與火蜥蜴、斑馬魚、非洲爪蟾等脊椎動物的再生能力相比就相形見絀了。為了促進再生醫學的發展，科研工作者在組織再生有關的生物學過程方面已經進行了許多努力。其中，斑馬魚和青鳉魚是被廣泛使用的脊椎動物模型，因為它們可以再生許多器官，例如中樞神經系統、心臟、腎臟，尤其是它們的尾鰭可以在截肢后具有無限的再生潛力。并且它們在幼魚階段具有透明的身體。為了研究組織再生過程中的生物學過程，生物學家最流行的研究方法是使用帶有熒光蛋白標記的轉基因熒光魚。盡管熒光蛋白融合的轉基因技術為研究活細胞中的蛋白質提供了可能性。然而，該技術復雜、費時、昂貴、易于光漂白。而且熒光蛋白的大分子尺寸可能會影響目標融合蛋白的功能。另一種流行的研究方法是熒光免疫組織化學染色。但是它需要固定和透化細胞，可能導致一些缺陷，例如，蛋白質被提取或移位、蛋白質表位受阻以及不能進行實時成像，因此可能導致一些生物過程的信息是錯誤的或者缺失的。因此，迫切需要一種簡單的研究方法，能夠實時觀察組織再生過程中的生物變化。

最近，香港科技大學唐本忠院士課題組與王文雄教授課題組合作，設計了一款比率計量型AIEgen探針，首次實現了在青鳉幼魚活體內實時監測其尾鰭再生過程中溶酶體pH的分布和pH值的變化。眾所周知，溶酶體pH是指示溶酶體水解酶活性和溶酶體功能狀況的重要參數，并且能提示細胞自噬的作用。因此，實時追蹤溶酶體的pH變化可以更全面地了解組織再生過程中的生物變化。

AIEgen的性質

適合用于組織再生期間追蹤溶酶體pH的探針需要滿足以下要求：（1）好的光穩定性；（2）長期跟蹤能力；（3）靶向溶酶體；（4）對pH敏感；（5）定量測量pH；（6）小魚體內無創成像。然而，傳統的ACQ探針由于強烈的π-π堆積而在高濃度或聚集狀態下存在熒光猝滅的問題，并且容易被光漂白，不適用于長期跟蹤。與ACQ材料相比，AIE材料越多，其亮度就越亮。近幾十年來的研究已證明AIEgens具有優異的光穩定性，大的斯托克斯位移，出色的長期跟蹤能力和良好的生物相容性。

圖1示出了AIEgen （CSMPP）的晶體結構和其聚集誘導發光的性質。

pH響應性和光穩定性

CSMPP質子化后分子內電荷轉移的增強引起發射光譜極大的紅移，基于此而實現了比率型pH探針。此探針克服了基于強度變化的熒光探針受探針濃度變化和分布不均，溫度，環境極性和激發光波動的影響的問題。CSMPP還具有pH響應的可逆性，而且能特異性測試pH而不受生命系統中某些常見化學物質的干擾，以及具有良好的光穩定性。另外，CSMPP的絕對pKa為4.75±0.02，剛好處于溶酶體的酸度窗口（pH 4.5-5.5），說明探針能夠測量溶酶體的pH。

圖2示出了CSMPP的pH響應性，可逆性以及抗干擾性。

圖3示出了CSMPP，LTR和LTG分別染色的HeLa細胞在使用CLSM連續掃描后的光穩定性。

青鳉幼魚成像以及尾鰭內溶酶體的靶向

熒光共定位成像的結果表明，CSMPP對幼魚尾鰭的溶酶體具有與LysoTracker DeepRed（LTDR）一樣好的靶向性。

圖4示出了青鳉幼魚的全身成像和尾鰭的溶酶體共定位成像。

魚細胞內pH的定量標準曲線

借助于H+/K+反向轉運尼日利亞菌素和H+/K+反向轉運莫能菌素來使細胞內外的pH均質化，獲得了不同pH下魚細胞的熒光比率圖像和pH校準曲線。結果顯示在pH 3.0-6.5之間呈線性關系，這種線性關系將用于計算尾鰭的溶酶體pH值。

圖5示出了小魚細胞在不同pH下的比率型熒光圖片以及探針的pH定量標準曲線。

長期追蹤青鳉幼魚的尾鰭再生過程

CSMPP追蹤了尾鰭從截斷到再生逐漸恢復變成圓形的過程。并且顯示了在截斷后平均溶酶體pH先逐漸降低，在截斷后24-48 h達到最低pH。這是胚細胞形成的階段。由于此階段的再生主要依靠自噬來清除損傷造成的受損組織和細胞碎片。因此，為了幫助自噬降解，細胞的溶酶體酸化被上調。而且在此階段，截斷平面周圍的溶酶體（包括再生組織）比遠離截斷平面的溶酶體的酸性更強。然后，隨著尾鰭的再生恢復，溶酶體的pH在120 h后也恢復至接近正常水平。

圖6示出了截斷前和截斷后不同時間的青鳉幼魚尾鰭的激光共聚焦圖片和溶酶體pH分布的比率型圖片。

圖7示出了青鳉幼魚尾鰭再生過程中其溶酶體的平均pH變化。

因此，該研究提供了一種簡單而定量的動態跟蹤方法來研究組織再生過程。并且該AIEgen探針還可用于追蹤各種溶酶體相關的生物過程，例如壓力反應，炎癥反應等。另外，該研究有助于啟發設計其它比率型熒光探針用于長期可視化跟蹤生物學的過程。以上相關成果發表在《Chemical Science》 (Chem. Sci., 2020,DOI: 10.1039/C9SC06226B.)上。論文的第一作者為香港科技大學博士后石秀娟，共同一作為香港科技大學博士生顏能，通訊作者為香港科技大學唐本忠院士，共同通訊作者為香港科技大學王文雄教授和郭子健研究助理教授。

參考文獻：X. Shi, N. YAN, G. Niu, S. H. P. Sung, Z.Liu, J. Liu, R. T. K. Kwok, J. W. Y. Lam, W. Wang, H. H-Y. Sung, I. D. Williamsand B. Z. Tang, Chem. Sci., 2020, DOI: 10.1039/C9SC06226B.

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