摘要

硫酸鹽還原菌 (SRB) 是一類廣泛存在于自然環境中可以利用硫酸鹽類物質作為呼吸代謝電子受體的厭氧類微生物，是造成金屬腐蝕破壞和設備故障的主要原因之一，已經成為一個重要的研究課題。由于微生物活動的復雜性，生物膜內SRB與金屬表面的相互作用缺乏深入的研究，其誘導腐蝕機理和腐蝕過程尚不清楚，難以進行有效的腐蝕預測。基于此，本文從SRB生物膜的呼吸代謝角度介紹了其誘導金屬腐蝕的研究進展。介紹了SRB的生態特征和厭氧呼吸過程，重點綜述了SRB腐蝕機理，包括陰極去極化、代謝產物腐蝕、濃差電池作用和胞外電子傳遞等理論，最后簡要介紹了微生物腐蝕 (MIC) 研究的方法與技術手段。

關鍵詞： 微生物腐蝕 ; 硫酸鹽還原菌 ; 腐蝕機理

腐蝕問題涉及各行各業，已經對人類的生活環境和經濟發展產生了嚴重的危害。根據《中國腐蝕成本》調查結果，2014年我國腐蝕成本超過2.1萬億元人民幣，占當年我國國內生產總值 (GDP) 的3.34%[1]，腐蝕防護已越來越被各行業各部門所重視。腐蝕防護關系到國家經濟發展、自然環境保護和人民健康安全，腐蝕問題在國家經濟社會發展過程中已經成為不容忽略的關鍵問題[2-4]。

微生物腐蝕 (MIC) 是指金屬或非金屬表面因微生物的生命活動而受到的腐蝕破壞。MIC是油氣管道、能源電力等許多行業中導致設施腐蝕失效，甚至造成重大經濟損失的一類重要腐蝕[3,4]，大約20%或更高的腐蝕損失是由微生物或其代謝活動引起的[5]。微生物在環境中與材料表面相互作用較為復雜，尚無標準的腐蝕模型對其進行預測和評估[6]。

硫酸鹽還原菌 (SRB) 屬于原核微生物，它們可以利用硫酸鹽作為末端電子受體進行呼吸代謝 (異化硫酸鹽還原)。SRB不僅局限于細菌，研究認為一些古菌也具有硫酸鹽還原功能[7]。目前已經進行了數十種SRB的研究，包括Desulfovibrio，Desulfomicrobium，Desulfobacter和Desulfotomaculum等，有些SRB甚至能夠進行有氧呼吸，但這個過程不能維持生長[8]，SRB不僅是缺氧環境中發生MIC的重要原因，其代謝過程在全球硫循環中也起到重要作用，具有重要的生態功能。

研究SRB腐蝕微生物的生理代謝過程，并揭示其對海洋工程材料的腐蝕機理，對微生物腐蝕防護研究有重要參考價值[9-11]。本文介紹了SRB的生態特征和其厭氧呼吸過程，然后介紹了SRB在材料表面生物膜的形成過程，綜述了SRB腐蝕機理，從經典的陰極去極化理論到胞外電子傳遞理論，最后簡要介紹了MIC研究的方法與技術手段。

1 SRB的生態和生理特征

1.1 SRB的生態特征

SRB廣泛分布在土壤、海水、河水、沉積物等自然環境以及地下管道油氣井、港口等設施材料生物膜中，最適宜的生長為pH6~9，溫度為20~30 ℃，生長所需的氧化還原電位 (OPR) 一般不高于-150 mV，它們對生長所需的環境有較強的適應性，某些SRB可以在50~60 ℃的高溫下存活，同時一些高鹽生態環境中也能檢測到它們的存在[12]。H2S對SRB的生長存在較大影響，一般認為濃度達到16 mmol/L就會對其生長產生明顯抑制效果[13]。在含有硫酸鹽的缺氧環境中，SRB通過獲取電子將硫酸鹽還原為H2S而獲得生長所需的能量，該電子通常來源于有機物質或分子氫的利用，分子氫是土壤、沉積物和其他缺氧環境中的常見發酵產物[14]。

通過研究不同地區的土壤SRB分布規律，顯示土壤中SRB的含量為10~1800 cell·g-1，土壤類型、溫度、氣候狀況和地理位置等因素都影響著SRB含量的分布[15]，緯度較高、年平均溫度較低的地區也不利于SRB的生長繁殖[16]。在海洋環境中，SRB廣泛存在于各個區域，主要分布在表層海水；隨著深度增加，SRB含量呈指數減少。例如，在加利福利亞太平洋表層海水中，SRB可達106 cell·g-1；而在780 m水深處，SRB含量銳減到103 cell·g-1。在近岸港灣、沿岸地區和污水處理廠附近SRB含量較高。據調查，中國山東乳山灣表層海水SRB含量為103~106 cell·g-1，在膠州灣潮間帶和沿岸區更可高達107 cell·g-1。SRB含量還呈現一定的季節變化趨勢[17]。2007~2008年對象山港海域的表層海水、上層海水和沉積物進行取樣，分析SRB豐度的時空分布特征及主要影響因素，其結果顯示水樣及沉積物中SRB的變化范圍為30~2300 cells·mL-1，且沉積物中的SRB含量最高，其豐度與環境關系較大，并且呈現出不均勻的狀態，人類活動對于SRB的分布有明顯影響[14]。隨著研究的深入，結果顯示SRB的分布也與有機質污染、營養鹽 (NO2-—N、NH4+—N)、pH及溫度等因素有關[18]。SRB生態分布特征為實際環境中微生物的分布和代謝研究提供了重要指導。本課題組[19-21]研究了實際海洋環境中金屬材料表面微生物群落的附著情況，結果表明不同海域生物群落有較大差異，對于三亞和廈門海域優勢屬為Bacillus和Vibrio；不同金屬材料附著的生物群落也有顯著差異，碳鋼銹層中硫酸鹽還原微生物為主要腐蝕微生物，由外銹層到內銹層的優勢菌屬分別為Desulfotomaculum、Desulfonatronum和Desulfovibiro。

1.2 SRB的厭氧呼吸

SRB在有機物的降解過程中以硫酸鹽 (SO42-) 作為末端電子受體還原產生H2S和CO2，因此，SRB在S和C的生物地球化學循環中起到重要作用，如圖1所示[22]。SRB將SO42-還原為H2S后，化能異養微生物可以將這些H2S氧化為單質硫 (S0)，并繼續氧化為SO42-；同時，大氣中的H2S也可以通過氧化和大氣沉淀作用形成硫酸鹽，繼而形成的SO42-又再次被SRB利用還原為H2S；SRB細胞通過有機硫的脫硫基分解作用也釋放出H2S，整個過程構成了SRB的硫循環系統。在碳循環中，SRB通過利用有機酸等有機物作為硫酸鹽還原過程中的電子供體而產生CO2，進入全球碳循環，CO2又可以通過光合作用和固碳微生物轉化為碳水化合物，這些復雜的碳水化合物又通過發酵微生物進一步轉化為簡單的有機物，從而繼續被SRB利用[6]。

圖1   SRB參與的碳循環和硫循環示意圖[22]

在生物硫循環過程中，SRB的厭氧呼吸過程如圖2所示[22]。有機化合物 (如乳酸) 氧化產生的H+通過SRB內活性Ech (Escherichia coli hydrogenase 3) 和COO (CO-dependent) 兩種酶循環到SRB胞質。在胞質中，H2被氫化酶重新氧化為質子和電子，質子為SRB提供了生長所必需的ATP，電子將傳遞到C型細胞色素 (cytochrome c3)，然后繼續傳遞到醌還原酶 (Qrc)，再傳遞到與醌作用的膜結合氧化還原酶 (Qmo)，最后傳遞到硫酸鹽還原的腺苷磷酸 (APS) 還原酶。同時，電子還通過未知的機制傳遞到異化亞硫酸鹽還原酶 (Dsr)，隨后傳遞到亞硫酸鹽 (SO32-) 還原酶。通過這一系列途徑，SRB能夠獲得足夠的電子將SO42-完全還原為H2S。同時，胞質中的乳酸會被分解為丙酮酸，進一步分解為甲酸，在甲酸脫氫酶 (Fdh) 的作用下最終分解為H+、CO2和電子，甲酸分解產生的電子和H2分解產生的電子在胞質內具有相同的傳遞路徑[23]。電子傳遞過程在能量學角度上也是完全可行的[24]。

圖2   SRB的厭氧呼吸過程[22]

SRB將S和C的生物化學循環結合在一起，其不僅能夠將乳酸、丙酮酸、簡單芳香族化合物 (苯或苯酚) 作為碳源，甚至能夠利用氨基酸或高分子鏈脂肪酸為其生長代謝提供能量，某些SRB還可以將硝酸鹽或分子氫作為替代的呼吸底物[25]。因此，對SRB的生態和厭氧呼吸代謝過程進行研究，對于控制微生物活動和進一步發展生物技術在環境修復、生物污染、能源生產、廢水處理和礦物回收等方面有重要意義。

2 SRB的附著和生物膜的形成

微生物在環境中可以以多種方式與材料表面相互作用，這使得MIC系統較為復雜，難以用標準的腐蝕模型評估預測。生物膜的形成使細菌能夠與材料表面密切接觸，并形成了與本體溶液不同的微環境，包括膜內pH、溶解氧、有機和無機離子等[26]。在各種環境中，微生物90%以上是以生物膜的形式存在，附著微生物群落的組成很可能是由生物膜的調節和材料表面的相互作用決定的。生物膜內包括細胞及其分泌的胞外聚合物 (EPS)，其中EPS是由多糖、脂質、核酸、蛋白質等有機和無機物構成，具有一定的強度和黏性，在金屬表面有較強的附著性，EPS含有的不同大分子物質在其粘附于材料表面后，為活性酶和氧化還原活性酶的產生提供了理想條件[27]。生物膜在材料表面起到屏障作用，一方面阻止溶液物質向金屬表面擴散，另一方面阻止膜內物質向溶液擴散，但是具體阻礙方式有待研究。圖3為SRB生物膜在金屬表面化學復雜性的示意圖及其在MIC中的影響。圖中，M為基體金屬，M2+為金屬離子，e-為電子。生物膜內SRB大量聚集，其代謝產生了大量H+、SO42-和NO3-，然而生物膜阻礙膜內外物質的流通方式尚不明確[28]。

圖3   SRB生物膜在金屬表面化學復雜性的示意圖及其在MIC中的影響[7]

生物膜是精細的三維結構，在具有強大剪切力的系統中，生物膜只有數微米厚；而在液壓壓力較小的區域，生物膜的厚度可以達到厘米級。在天然海水中，生物膜的厚度為50~150 μm[29]。生物膜的形成和增長過程可以分為6個階段：(1) 在金屬表面形成吸附膜；(2) 浮游微生物在吸附膜的吸引下遷移到材料表面；(3) 浮游微生物附著在材料表面的活性部位，轉化為固著微生物；(4) 固著微生物生長并產生代謝產物，形成生物膜；(5) 隨著代謝產物和固著微生物的增加，形成成熟穩定的生物膜；(6) 隨著時間的推移，生物膜的穩定性降低，部分生物膜脫落，形成異質生物膜[30]。

研究[31-33]表明，生物膜形成的不同時期對腐蝕的影響也不同，最終不穩定生物膜脫落形成的異質生物膜會引起材料的局部腐蝕，加速腐蝕速率。當材料表面出現異質生物膜時，生物膜中致密部位會阻止O2的擴散，生物膜中的好氧細菌也會消耗生物膜內的O2，這兩種效應共同作用下會產生低氧濃度的區域，這些區域成為材料腐蝕的陽極。同時，具有較低密度的生物膜或沒有生物膜的部位具有較高的氧濃度，成為陰極，在材料表面形成氧濃差電池，引起局部腐蝕。微生物膜的組成和形成過程是一個很復雜的生物化學過程，同時環境因素對生物膜的形成過程影響很大，膜內微生物種群間的相互作用也極為復雜，實驗室條件下還不能模擬出自然環境下形成的生物膜[34]。

3 SRB腐蝕研究進展

3.1 氫化酶陰極去極化理論

1934年von Wolzogen等[35]提出了氫化酶陰極去極化理論，陰極去極化理論將這種金屬破壞歸因于陰極氫的微生物消耗。在沒有氧的條件下，金屬腐蝕的陰極反應是H+的逸出，但由于H+的過電位太高，腐蝕電池本身難于供給這樣的電位，因而陰極被一層H2所覆蓋，使得金屬腐蝕中止。在SRB存在情況下，其能夠從金屬表面除去H2，從而使腐蝕過程繼續。之后，Booth等[36]證明Desulfovidrio vulgaris可以使低碳鋼表面的陰極區域去極化，利用陰極極化的氫還原硫酸鹽，促進鋼的腐蝕，為陰極去極化理論奠定了基礎。

該理論提出后，眾多研究者深入研究，并在不斷的探索中完善了陰極去極化理論。Muyzer等[37]基于氫化酶陰極去極化理論建立MIC模型，如圖4所示。SRB在金屬表面吸附后利用體內的氫化酶將SO42-還原成H2S，同時將金屬表面陰極上生成的H除去，局部分壓降低，并且通過這種“去極化”作用使得Fe溶解，反應如 (1)~(7) 式：

圖4   氫化酶陰極去極化機理圖[36]

近幾年，陰極去極化理論不斷完善。大多數研究者認為擴散溶解的H2進入SRB細胞后，最終到達細胞質膜，在氫化酶的生物催化作用下被利用，膜結合的氫化酶和多血紅細胞色素通過黃素氧化還原蛋白 (或其他電子載體) 將電子傳遞到APS，使細胞質中的硫酸鹽還原。實驗室封閉環境模擬SRB腐蝕行為的研究顯示，隨著金屬材料腐蝕時間的延長，其腐蝕速率和EPS中蛋白質數量顯著增加，這可能與SRB細胞內的氫化酶有關，材料表面溶解的Fe增加了氫化酶的合成，更多的氫化酶合成增加了細菌的代謝活性，從而加速腐蝕[38]，da Silva等[39]的研究也有相似結果。通過計時安培法和循環伏安法研究D. desulfuricans 27774對不銹鋼和石墨電極表面生物膜的電活性影響，結果顯示，氫化酶與不銹鋼和石墨表面存在電子通道，可以進行直接電子轉移，推測電子通道也可以讓營養物質和O2擴散，形成濃度梯度[40]，Yu等[10]研究表明，實驗室石墨電極表面形成SRB能夠催化氫的氧化還原，推測氫化酶在電子傳遞過程中具有重要作用。Cu2+和Ag+對Desulfovibrio sp.細菌的影響研究表明，表面生物膜元素成分分析表明S峰值很高，這可能是在氫化酶的作用下形成了非均勻的FeS腐蝕產物膜，對材料起到一定保護作用[41]。同時，研究者根據陰極去極化理論研發了一套點蝕預測系統，利用計算機仿真研究SRB的腐蝕過程[42]。

氫化酶還同時起到了能量調節的作用。當碳源缺乏時，氫化酶可以增強SRB的還原硫酸鹽能力；當碳源不可用時，氫化酶可以促進SRB直接獲取電子，這些代謝途徑研究對MIC的認識有重要意義。在未來研究中，深入認識氫化酶在MIC中的作用對于生物能源和生物技術的利用也具有重要意義[43,44]。

3.2 代謝產物腐蝕理論

微生物分泌的腐蝕性代謝物質引起的MIC可以稱為代謝產物腐蝕 (M-MIC)，如圖5所示[45]。腐蝕性代謝物質包括H+、有機酸和硫化物等氧化劑。研究[46]表明，生物膜中產酸菌 (APB) 分泌的有機酸、SRB排出的H2S均能加速腐蝕。M-MIC本質是一個電化學腐蝕過程，Fe氧化和H+還原是兩個可分離的電極反應。除了SRB和APB等細菌外，真菌 (如黑曲霉) 也會分泌酸性代謝物，從而引起M-MIC。

圖5   FeS代謝產物腐蝕機理圖[45]

SRB對銅合金的腐蝕研究結果顯示，由于硫酸鹽還原電位低于Cu+/Cu和Cu2+/Cu電位，Cu不能給SRB的硫酸鹽還原過程提供足夠的能量，因此SRB對Cu的腐蝕是由SRB代謝產生的硫化物引起，直接證明了銅合金腐蝕是由M-MIC造成的[47]。同時，通過控制溶液環境中硫化物含量也證明了D. vulgaris對Cu的腐蝕方式為M-MIC[48]。研究者改變培養體系中SRB代謝產生的H2S含量，研究H2S對SRB生長代謝和碳鋼腐蝕的影響。結果顯示，培養體系中氣體剩余體積越大，SRB代謝產生的H2S越多，溶液中溶解的H2S更少，浮游細菌和材料表面附著細菌的數量均增加，導致MIC更嚴重[49]。

介質中Fe2+和Fe3+濃度是影響M-MIC的一個重要因素，研究人員開展了大量工作研究Fe2+對SRB和FeS薄膜影響[50]。劉宏芳等[51]研究表明，介質中不同濃度的Fe2+在碳鋼表面形成的FeS腐蝕產物膜不同，對碳鋼的腐蝕影響差異較大。更多的研究[52]表明，低碳鋼的腐蝕速率與溶液介質中的Fe2+濃度成正比，Fe2+的存在改變了FeS膜的類型，Fe2+含量的增加會導致FeS膜的斷裂，從而增加腐蝕速率。關于Fe2+和Fe3+對SRB腐蝕的影響，人們提出了許多猜測，包括Fe/FeS引起電偶腐蝕、陰極去極化影響、氫化酶調節和FeS薄膜物理性質的變化。Fe2+和Fe3+在SRB細胞內起到什么作用以及對FeS膜的形成有什么影響還需要進一步研究。

H2S的含量對SRB代謝產物也有重要影響。生物膜中SRB的數量可以達到108 cell·cm-2，其產生的腐蝕性H2S會引起膜內局部pH降低，造成嚴重局部腐蝕[53]，同時，SRB代謝產生的硫化物會減弱金屬鍵在材料表面的結合力，導致金屬的陽極溶解速率增加[54]。Desulfovibrio sp.細菌對316L不銹鋼的腐蝕研究結果表明，該細菌能有效利用H2，但在給定電位下316L自腐蝕電位和腐蝕電流密度不變，材料表面沉積的FeS對陰極反應沒有明顯的催化作用，因此H2消耗不是微生物腐蝕的決定性因素，而FeS作為一種半導體薄膜會影響電子從金屬移動到細胞，在厭氧腐蝕中發揮著重要作用[55]。Iverson[56]綜述了厭氧腐蝕機理，認為材料腐蝕速率與Fe2+和H2S有關，Fe2+和H2S反應使基體表面形成鐵硫化合物的薄膜，從而使細菌與基體表面不直接接觸，其腐蝕速率增加。

生物膜中M-MIC過程會產生少量的H2，這部分H2被認為是含有氫化酶微生物的能量來源，目前尚不清楚M-MIC過程產生的代謝產物是不是其他微生物的能量來源，未來還需要進一步進行相關實驗論證。

3.3 濃差電池作用理論

1958年，Starkey[57]首先提出濃差電池理論，即金屬材料表面被腐蝕產物或者其它污垢覆蓋時，在材料表面與介質的界面處會形成濃差電池。1964年，King等[58]研究表明，FeS沉積在材料表面形成的濃差電池是金屬腐蝕的原因。

之后的研究進一步表明濃差電池的形成與生物膜的結構和形成有關[59]。材料在海洋和油氣環境下形成的生物膜，膜內含有大量的好氧菌，好氧菌在生物膜內分布不均勻，通過呼吸作用消耗了生物膜內的O2，使得這些區域O2濃度較低成為陽極區，而生物膜密度較小或沒有生物膜覆蓋的區域具有較高的氧濃度成為陰極區。由于氧濃度差異而引起的局部腐蝕過程稱為氧濃差電池，如圖6所示[6]。Skovhus等[9]綜述了油氣管道MIC機理，生物膜內固體有機和無機顆粒沉降在管道表面時會形成不同電偶電位區域，引起濃差電池腐蝕。因此，生物膜的研究對于濃差電池的作用機理認識至關重要。

圖6   生物膜內氧濃差電池點腐蝕機理圖[6]

近幾年，研究人員在MIC方面進行了大量研究工作，濃差電池作用機理也較為完善。研究者[60]進行了低合金鋼在海水中的氧濃差電池腐蝕行為研究，將低合金鋼的耐蝕性分為3類，之后進一步研究了低合金鋼中不同元素形成的氧濃差電池差異。對潿洲油田套管斷裂事件的原因分析，認為該事件是由于隔水管泄漏，使得套管與海水直接接觸，在海平面處形成了宏觀氧濃差電池導致套管腐蝕斷裂失效[61]。通過電化學和表面分析方法研究SRB對鋼的腐蝕影響，可見隨著培養時間的增加，SRB的腐蝕電位升高，由于溶液中形成了FeS，培養基顏色由灰色變為黑色，鋼在SRB中的腐蝕速率增加，可能是因為其陰極反應速率增加使硫酸鹽還原為硫化物的速率增快從而形成了濃差電池[62]。Moon等[63]在之后的研究進一步表明，SRB存在下的陰極反應加速的同時也提高了陽極反應速率和腐蝕速率，SRB生物膜內形成了氧濃差電池，并引起了嚴重的點蝕。

3.4 胞外電子傳遞理論

研究[64-66]表明，微生物能直接從金屬表面獲取電子，加速金屬的溶解。Dinh等[67]以金屬Fe作為唯一電子供體從海洋中分離培養得到一株新型腐蝕性SRB，通過測量其產生的硫化物、CH4、H2等代謝產物，顯示能夠直接從金屬Fe中獲得電子的新型SRB比傳統的SRB硫酸鹽還原得更快。經典的陰極去極化理論明顯不能解釋這類細菌的腐蝕行為，細胞外電子傳遞 (EET) 理論的提出，很好地解釋了這類細菌的腐蝕機理[68,69]。胞外電子傳遞依賴于生物膜的形成，電子與離子不同，電子不能在液體中獨立存在，而生物膜內電子載體較多，更有利于浮游細菌的利用。近年來許多研究者研究了SRB和硝酸鹽還原菌 (NRB) 在MIC中的跨膜電子傳遞機理，進一步完善了該理論[7]。

胞外電子傳遞有兩種方式，如圖7所示[69]，包括直接電子傳遞 (DET) 和電子載體電子傳遞 (MET)。直接電子傳遞包括兩種方式：(1) 依賴于外膜結合的氧化還原活性蛋白與基體導體表面直接接觸，如C型細胞色素；(2) 依賴于導電菌毛 (導電納米線) 與導體表面接觸。電子載體電子傳遞需要利用可溶性電子載體物質，如H+/H2、核黃素和黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 等氧化還原活性物質。對于MIC中的胞外電子傳遞，電子通過DET或MET兩種方式傳遞到與細胞外膜結合的氧化還原蛋白處，電子進入細胞后，細胞內的電子傳輸鏈 (ETC) 通過一系列的氧化還原反應將電子傳遞到細胞質中的末端電子受體[70]，即SRB厭氧呼吸中的硫酸鹽。對于細菌，ETC也依賴于各種與細胞質膜結合的氧化還原活性物質，如細胞色素和核黃素類，研究表明這類氧化還原活性物質作為電子媒介會加速碳鋼和不銹鋼的SRB腐蝕[68]。

圖7   SRB 從金屬到細胞表面電子傳遞的3種方法[69]

依賴于外膜結合的氧化還原活性蛋白進行的DET已經成為了研究熱點。對D. Corrodens strain IS4典型腐蝕SRB的研究表明，從電極上獲取電子并不局限于鐵作為微生物代謝的唯一電子供體，細菌也能夠在石墨和摻雜鍺的陰極上獲取電子，同時通過紅外光譜電化學方法，認為C型細胞色素是與外膜相關的氧化還原活性成分并且直接參與IS4細菌從基體表面直接獲取電子[8]，具有這種功能的微生物可以稱為電營養微生物[19]。但是，氧化還原活性蛋白對電子的吸收也存在爭議。研究者對SRB存在下管線鋼涂層的電化學腐蝕研究表明，必須具有足夠的負電荷SRB自身蛋白才能直接攝取電子[71]。未來應用生物學等技術手段分離具有氧化還原活性成分的細菌細胞外膜，進行功能分析，將有助于研究外膜細胞色素在整個DET過程中的作用，從而具體描述電子通過氧化還原活性蛋白在整個細胞中的傳遞過程。

依賴于導電菌毛 (納米線) 進行的DET也已進行了大量研究[69]。研究者[72]認為在沒有有機碳源的培養基中，SRB細胞表面會出現大量菌毛附著在Fe表面，而在培養基中加入有機碳培養源，則未觀察到這些菌毛[73]，進一步研究顯示SRB細胞利用這些菌毛從碳鋼表面直接獲取電子進行硫酸鹽還原從而在碳源缺乏環境中存活。Reguera等[74]的研究也顯示Geobacter sulfurreducens細菌菌毛缺失的突變體不能還原鐵 (III) 氧化物，但能吸附在鐵氧化物表面，電子探針原子力顯微鏡也顯示該菌毛具有良好的導電性。這些研究表明，SRB細胞的菌毛可以作為生物納米線，將電子從細胞表面轉移到鐵 (III) 氧化物表面。除了作為電子轉移通道，菌毛還可以參與其他電子轉移反應，例如，單個SRB的菌毛經常交織在一起從而增加菌毛間細胞電子轉移的可能性[75]。該理論為獨特的細胞表面和細胞間相互作用提出了新的解釋，也為新型導電材料的研究提供了可能性。通過進一步理論研究，這類細菌制造的納米線在納米電子和基因修飾方面將有很大的應用前景。

研究者對MET方式進行的胞外電子傳遞進行了初步探究[6]。核黃素和黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 兩種電子傳遞介質對Pseudomonas aeruginosa生物膜和碳鋼的腐蝕影響研究表明，兩種電子傳遞介質對碳鋼腐蝕有明顯的促進作用且碳鋼表面點蝕坑更深，而溶液中浮游細菌沒有太大變化[76]。Zhang等[77]用同樣方法證明電子傳遞介質會增加304不銹鋼的點蝕和失重。目前對電子載體傳遞機理的研究仍相對較少，電子傳遞介質在整個電子轉移過程中的作用還需要進一步研究。

胞外電子傳遞相關基因研究，可以闡明電子傳遞在MIC中的重要性。Huang等[78]對P. aeruginosa內合成內源性電子介質吩嗪-1-甲酰胺的PhzH基因進行敲除，結果證明，PhzH的缺失降低了2205雙相不銹鋼的腐蝕速率，而在敲除的P. aeruginosa中恢復了該基因，腐蝕速率基本恢復。從分子和遺傳水平上闡明SRB中的胞外電子傳遞的機制，有助于證明EET和MIC的相互關系，還需要進一步的研究和更多的證據。

胞外電子傳遞機理的研究對腐蝕保護應用有重要意義[14]。通常使用外加電流陰極保護 (ICCP) 作為一種常用的抑制微生物腐蝕的方法，但電營養微生物存在時，該方法的使用會為微生物代謝提供電子，促進Desulfovibrio這類SRB和其他電營養微生物在陰極保護設施周圍繁殖代謝，造成ICCP系統失效，使材料設施暴露在富含硫化物的沉積物和腐蝕性微生物群落中。已有研究[79,80]顯示，SRB存在下，在0.85 V (vs SCE) 陰極保護電位 (CP) 下，EQ70高強度鋼的腐蝕速率高于無CP的，而在-1.05 V (vs SCE) 下，EQ70的腐蝕速率低于無CP的，SRB在0.85 V (vs SCE) 時代謝活性增強很可能是由極化電極的直接電子傳遞引起。

隨著MIC研究的進展，研究人員[9,81]進一步提出了生物催化陰極硫酸鹽還原 (BCSR) 理論，從生物能量學和生物電化學的角度進一步地解釋了MIC的作用機理[81,82]。對于SRB引起的MIC，乳酸等脂肪酸通常作為其生長的有機碳源和電子供體，硫酸鹽作為末端電子受體完成氧化還原反應過程。在BCSR理論中，當SRB在鐵表面形成生物膜時，由于受到擴散和頂層生物膜對碳源消耗的限制，碳源很難到達貼近金屬表面的SRB生物膜，靠近金屬表面的固著SRB基本沒有能夠利用的碳源，此時饑餓的SRB將使用易被腐蝕的金屬 (如Fe) 作為電子供體從而獲取其生長代謝所需的能量。圖8為有機碳-硫酸鹽還原和以Fe為電子供體的BCSR之間的差異[83]。因此，BCSR理論回答了當生物膜中碳源缺乏時，微生物腐蝕金屬的目的是從這個過程中獲得能量來維持它們的生長代謝。

圖8   有機碳-硫酸鹽反應和BCSR中SRB以鐵為電子供體的腐蝕示意圖[83]

當Fe被SRB腐蝕時，SRB外部發生金屬鐵的氧化，而硫酸鹽還原發生在SRB內部。因此，Fe氧化釋放出的電子將穿過SRB的細胞壁，最終達到其細胞質內發生硫酸鹽還原反應的位置。細胞外電子傳遞到細胞內部方式為胞外電子傳遞，包括DET和MET機制。該理論很好地解釋了微生物為什么和怎樣腐蝕金屬，是研究MIC的新方法和思路。未來還需要進一步跟蹤電子在細胞內外的傳遞途徑，進一步解釋腐蝕產物的形成過程和變化原因。

4 MIC研究方法與技術手段

MIC涉及材料 (冶金)、微生物和電化學多學科交叉，需要運用到電化學方法、表面分析方法、微生物學和分子生物學等多種技術手段進行研究。

由于生物腐蝕基本上是一個電化學過程，生物膜的三維結構和其化學成分都會隨著時間而改變，因此電化學方法常被應用于微生物腐蝕的監測和機理研究[84-86]。研究[87]表明傳統電化學技術 (包括動電位極化曲線法、LPR和EIS) 由于外部施加的電場會導致部分細菌的損傷和死亡，減低微生物活性。Zhao等[87]比較了Pseudomonas aeruginosa存在下不同電化學技術對2205不銹鋼連續腐蝕監測后生物膜的影響情況，認為EIS和LPR監測會抑制細菌生長并顯著降低生物膜厚度和腐蝕性，導致腐蝕速率和點蝕坑深度明顯降低。而新型電化學技術——電化學噪聲法不需要對體系施加劇烈擾動，不會對微生物的生長繁殖產生干擾，對生物膜的影響和材料腐蝕影響很小，從而獲得最接近的腐蝕速率和點蝕坑深度。新型電化學技術包括微區電化學法、掃描電化學顯微鏡技術、電化學噪聲法等。Zhou等[88]使用電化學噪聲法研究了Pseudomonas aeruginosa在2205不銹鋼表面的點蝕瞬時形成過程，證明了細胞外電子傳遞機理。因此，新型電化學技術可以對亞穩態點蝕、穩態點蝕和離子溶解等過程進行快速、小時間尺度的原位表征分析，在不影響微生物活性的同時，可以獲得更多的電化學反應界面動力學信息，對于MIC研究有很重要的幫助。

表面分析技術是腐蝕研究的重要方法，對微生物腐蝕研究具有重要意義。表面分析技術包括掃描電鏡-能譜儀 (SEM-EDS)、原子力顯微鏡 (AFM)、X射線光電子能譜分析 (XPS)、飛行時間二次離子質譜 (ToF-SIMS) 和激光掃描共聚焦顯微鏡 (CLSM) 等。每一種表面分析技術都有其獨特的優點和局限性，對樣品的處理也各不相同，只有充分認識每一種分析技術，才能更好地發揮其優點。已經有大量文獻進行了微生物對材料表界面的研究[89-91]，對微生物產生的代謝產物或生物分子 (如酶、糖等) 進行了定性和定量的研究分析，這對微生物腐蝕機理的認識起到了關鍵作用。隨著腐蝕研究的深入，對表面分析技術的精度等各方面要求也更高。El Menjra等[92]利用ToF-SIMS技術研究了Fe表面生成鐵硫化物的來源，通過計算鐵硫化層中硫同位素的分餾值，可以區分生物和非生物形成的硫化物，有助于更好地研究含硫環境中鐵表面非生物或生物形成的鐵硫化物過程及其相互作用。多種表面分析技術的結合使用也是未來腐蝕研究發展的趨勢，Li等[93]采用聚焦離子束掃描電子顯微鏡 (FIB-SEM) 研究了SRB在生物膜中的分布情況和基體表面點蝕的縱向元素分布，研究表明生物膜具有一定的陰離子選擇性并提出了MIC點蝕機理。因此，更加精確的原位表面分析技術對MIC研究有重要意義。

微生物學或生物化學方法是MIC研究的基礎。微生物的培養對MIC研究十分重要，培養基的選擇改良對體系微生物的生長代謝有較大影響。世界上現有的大約95%的微生物還不能培養。此外，不同微生物的培養時間不同，從24 h到幾周不等，具體取決于樣品的種類和體系配比[94,95]。因此，進行微生物腐蝕研究時對于微生物的選擇與培養應該十分重視。

分子生物學方法是MIC研究的新趨勢。隨著分子生物學技術的發展普及和研究成本的降低，生物腐蝕研究中對微生物群落的DNA/RNA/蛋白質的研究開始增加。分子生物學不受培養的限制，可以通過保守的核糖體基因 (16S rDNA或23S rDNA) 研究微生物群落對腐蝕的影響，可以通過RNA或蛋白質研究微生物的代謝活性，也可以通過研究生物腐蝕過程相關的功能基因 (如APS還原酶基因apsA) 從而研究電子在細胞內傳遞途徑[96-98]。Smith等[50]開展了近岸低海水腐蝕區的SRB腐蝕行為研究，采用宏基因組方法研究了細菌體內硫循環過程。Palacios等[99]采用16S sRNA方法研究了Sporomusa和Methanosarcina兩種細菌共存下的電子傳遞機制。因此，分子微生物學的研究方法可能會成為未來微生物腐蝕機理研究的熱點。

在進行MIC研究時必須注意樣品的采集和保存過程；進行SRB腐蝕研究時，一些測試要求樣品在低溫甚至在缺氧環境中保存，以防止某些化合物表面在環境中氧化。MIC是一門交叉學科，多種研究手段的交叉使用也是為了更好地研究腐蝕，但是這對研究者也極具挑戰[100-102]。

5 總結

微生物腐蝕研究已經有100多年歷史，針對SRB腐蝕機理也進行了多年研究，采用電化學、材料學和微生物學的方法，已提出了陰極去極化等多種經典的腐蝕機理，近年來由于微區電化學和分子生物學等方法引入MIC研究中，從生物能量學和生物電化學角度提出了胞外電子傳遞理論。當溶液環境中有充足的碳源 (如乳酸) 時，SRB優先利用有機物質作為電子供體，而由于受到擴散和頂層生物膜對碳源消耗限制，碳源很難到達貼近金屬表面的SRB生物膜，易被腐蝕的金屬 (例如Fe) 成為唯一電子供體，此時金屬表面SRB會通過胞外電子傳遞方式獲得金屬電子。胞外電子傳遞方式包括氧化還原活性蛋白、細菌納米線和可溶性電子載體3種方式，從而引起金屬材料腐蝕。未來還需要進一步跟蹤電子在細胞內外的傳遞路徑，通過基因工程等方法抑制某些特定基因或蛋白酶的表達，探究腐蝕過程中的電子傳遞載體，并結合多種研究方法以進一步研究SRB腐蝕機理。

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