1. 冷凍掃描電鏡概述

    常規掃描電鏡要求所觀察的樣品無水，而一些樣品在干燥過程中會發生結構變化，致使無法觀察其真實結構。冷凍掃描電鏡技術能夠對含水（溶劑）樣品進行成像和分析，實現對于液態樣品（如乳液、囊泡等）及不耐電子束損傷樣品的微觀形貌的觀察。在冷凍掃描電鏡觀察前，液態樣品經過低溫冷凍固定、斷裂、鍍膜（噴金/噴碳）等制樣處理后，再通過冷凍傳輸系統將其置于電鏡內的冷臺（溫度可至-185℃即可進行觀察。其中，快速冷凍技術可使水在低溫狀態下呈玻璃態，減少冰晶的產生，從而不影響樣品本身結構，冷凍傳輸系統保證樣品傳輸過程中保持低溫狀態，整個系統從制樣到觀察都在低溫下進行，盡可能保持樣品在液相中的原位結構。

    2. 系統組成及流程

    冷凍掃描電鏡系統包括冷凍固定、冷凍斷裂、升華及導電性噴涂等制樣設備，冷凍傳輸裝置及掃描電鏡的冷臺，樣品首先經過高壓冷凍或液氮泥方法進行冷凍固定，然后在冷凍條件下傳輸到真空濺射儀中進行斷裂，露出樣品新鮮的斷裂面，并根據樣品情況進行升華防止表面被冰包覆，之后進行導電性噴涂，至此制樣完成，通過冷凍傳輸系統將樣品置于掃描電鏡的冷臺進行觀察。分析測試中心電鏡組現有的冷凍掃描電鏡系統包括高壓冷凍儀 Leica EM HPM100、冷凍傳輸樣品桿 Leica EM VCT100、離子濺射儀 Leica EM ACE600、自制的液氮泥冷凍裝置、冷凍掃描電鏡用的冷臺。

    2.1 冷凍固定

    2.1.1 高壓冷凍固定

    冷凍固定的目標是在低溫下使液態樣品中的水不結晶而呈玻璃態，這樣既能將樣品在液相的狀態固定，又避免了水結晶引起樣品結構的破壞。因此，冷凍固定的關鍵是要阻止冰晶形成，冷凍固定是否成功，取決于冷凍過程迅速通過一個溫度范圍，即水開始結晶的溫度到開始重結晶的溫度區間，此區間受環境壓力、樣品濃度等因素的影響。如圖 1[1]所示，第一行是常壓下的純水，從 273 K 開始結晶，因考慮到過冷水的作用，所以從 231 K 開始結晶，當溫度低于重結晶溫度 136 K 時，結晶過程停止。第二行是常壓下的樣品，通常樣品包含溶質會降低樣品的熔點（與溶質濃度有關系），同時提高重結晶溫度，使得結晶的溫度區間減小。第三行是施加 204.5 MPa 壓力的樣品，可以看出，施加高壓會進一步降低樣品的熔點且提高重結晶的，所以結晶的溫度區間進一步減小。

    因此，可用高壓冷凍的方式將液態樣品進行快速冷凍固定，具體如圖 2[1]所示，在 10ms 內，壓力由常壓瞬間升高至約 200 MPa，同時用液氮使樣品溫度迅速下降，當通過水的結晶區間，直到溫度低于約 136 K 后，即形成玻璃態的水。對于 200 ?m [3]厚的樣品，樣品中心區域通過這一溫度區間大約需要 30 ms。

    具體操作流程如下，用移液槍將待測樣品滴入冷凍樣品夾片的下片，下片中有凹槽，可儲存一定量的液體樣品，然后蓋上夾片上片，組成一個三明治結構，上下兩片的材質均為銅鍍金，之后將載有樣品的整個夾片置于綠色的固定片上，推入高壓冷凍儀中即可進行高壓冷凍固定（圖 3），每次進行一次高壓冷凍，儀器會生成一條冷凍曲線，根據曲線中達到目標壓力和溫度的時間可初步判斷冷凍固定的效果。

    2.1.2 液氮泥冷凍固定

    高壓冷凍固定的方法雖然能較好的使水固定在玻璃態，但是高壓會影響某些樣品的微觀結構，而且高壓冷凍儀價格昂貴。還可應用液氮方式進行冷凍固定，即將液氮置于真空中，在一定的負壓下（通常200Pa） [3]，液氮由液態逐漸變為固態，形成液氮泥。由于萊頓弗羅斯特效應（指液體不會潤濕炙熱的表面，而僅僅在其上形成一個蒸汽層的現象），當直接將樣品放入液氮中時，樣品周圍的液氮會立即沸騰，將樣品包裹在絕緣的氮氣中，從而使樣品不能立即降溫，水成為結晶態。而將樣品置于液氮泥中，由于液氮泥不存在沸騰現象，所以樣品不會收到萊頓弗羅斯特效應的影響，可迅速降溫通， 使得水分子來不及重排成晶體，從而形成玻璃態的水。 如果是液體樣品，可用夾片裝載樣品直接投入到液氮泥中進行冷凍固定，固體樣品則可直接用低溫膠粘在樣品臺上投入液氮泥中進行固定。

    2.2 冷凍斷裂/噴涂

    將應用高壓冷凍或液氮泥冷凍固定的樣品在液氮中轉移至冷凍樣品臺裝載裝置中，在其中將冷凍好的樣品裝載于冷凍傳輸樣品桿上。然后通過冷凍傳輸樣品桿將載有樣品的樣品臺轉移至 EM ACE600 濺射儀中（圖 4）應用濺射儀中的刀對樣品進行冷凍斷裂，露出樣品新鮮的斷面，對于有些樣品，在 173K 下進行升華，避免樣品被水包裹覆蓋，之后進行導電性噴涂，避免在掃描電鏡觀察過程中放電現象的發生（圖 5）。

    2.3 冷凍掃描電鏡觀察

    通過冷凍傳輸樣品桿將斷裂、噴涂好的樣品轉移至掃描電鏡的冷臺，冷臺是由液氮降溫經銅帶導溫來控制溫度（ 123K），在掃描電鏡觀察時，通常應用較低的加速電壓和較小的束流，以減弱放電現象和電子束對樣品的損傷。由于整個傳輸及觀察過程都保持在低溫狀態，所以盡可能的保持了樣品在液相的原位結構。

    3. 冷凍掃描電鏡的應用實例

    3.1 微乳液

    圖 6 為微乳液樣品分別經高壓冷凍和液氮泥冷凍固定，并經冷凍斷裂/噴涂后，傳輸到冷凍掃描電鏡得到的形貌圖，可以看出冷凍方法能夠保持乳液中液滴的結構，液滴大小不一， 2 ?m 至 20 ?m。但是應用高壓冷凍方法制得的樣品，液滴呈橢球型，可能是由于液滴受高壓擠壓而變形所致，而應用液氮泥制樣得到的樣品液滴呈球型，保持了其本來的形貌。

    3.2 納米片穩定的水包油體系

    圖 7 為用納米片穩定的微乳液經液氮泥冷凍固定、并經冷凍斷裂/噴涂后，傳輸到冷凍掃描電鏡得到的形貌圖，可以看出納米片包覆在油滴表面，并且沿一定的方向排列，據此可以得出納米片在水包油穩定體系中的存在狀態，從而推斷穩定機理。

    圖 7 為用納米片穩定的微乳液經液氮泥冷凍固定、并經冷凍斷裂/噴涂后，傳輸到冷凍掃描電鏡得到的形貌圖，可以看出納米片包覆在油滴表面，并且沿一定的方向排列，據此可以得出納米片在水包油穩定體系中的存在狀態，從而推斷穩定機理。

    3.3 磷脂、二肽分子自組裝體

    圖 8 是磷脂、二肽分子自組裝體經液氮泥冷凍固定并經冷凍斷裂/噴涂后，傳輸到冷凍掃描電鏡得到的形貌圖，可以看出分子組裝成棒狀結構，棒的粗細在 500nm，每根棒又是由多根纖維組成。

    3.4 水凝膠

    圖 9 是水凝膠分別經過冷凍干燥之后在常溫掃描電鏡上觀察到的形貌圖和經液氮泥冷凍固定并經冷凍斷裂/噴涂后，傳輸到冷凍掃描電鏡得到的形貌圖。可以看出冷凍干燥的水凝膠孔徑較大且稀疏，可能是由于水分在真空中揮發后樣品因為沒有水分的填充導致孔塌陷。而未經過可以看出孔徑很小且密集，因為真空干燥的水凝膠在冷凍固定的時候有水分填充，不會導致樣品塌陷，因此冷凍掃描電鏡的方法保持了水凝膠本身的結構。

更多關于材料方面、材料腐蝕控制、材料科普等方面的國內外最新動態，我們網站會不斷更新。希望大家一直關注中國腐蝕與防護網http://www.ecorr.org

責任編輯：王元

《中國腐蝕與防護網電子期刊》征訂啟事

投稿聯系：編輯部

電話：010-62313558-806

郵箱：fsfhzy666@163.com

中國腐蝕與防護網官方 QQ群：140808414